阮洪生，賈桂燕，吳志軍，鄭小亮

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校）

超聲輔助雙水相體系提取水飛薊中水飛薊賓的工藝優(yōu)選

阮洪生1，2，賈桂燕1，吳志軍1，鄭小亮1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校）

為優(yōu)化水飛薊中水飛薊賓的提取工藝，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨用量、料液比和超聲時(shí)間為自變量，水飛薊賓含量為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選超聲輔助雙水相體系提取工藝參數(shù)。研究結(jié)果表明，最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為57%，硫酸銨的用量為0.26 g·mL-1，料液比為25 mL·g-1，超聲時(shí)間為19 min，水飛薊賓含量為10.18 mg·g-1。該工藝適用于水飛薊中水飛薊賓的提取，方法簡(jiǎn)單，預(yù)測(cè)性較好。

雙水相；超聲提?。凰w薊；水飛薊賓

水飛薊為菊科植物水飛薊Silybum marianum（L.）Gaertn.的干燥成熟果實(shí)，具有清熱解毒，疏肝利膽的功效，用于治療肝膽濕熱、脅痛、黃疸[1]。水飛薊中提取的水飛薊素為黃酮木質(zhì)素，其中水飛薊賓含量最高，也是水飛薊素中的主要活性成分[2-3]。研究報(bào)道水飛薊賓具有抗氧化、抗癌、抗炎、抑菌、抗抑郁和降血脂等藥理活性[4]。

水飛薊素的提取方法有堿提酸沉法、有機(jī)溶劑提取法、熱回流提取法、超聲波提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法等[5]，各種提取方法利弊不同。超聲提取法也是常用的提取物方法[6-8]。雙水相提取技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥活性成分分離，文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在黃酮、生物堿、萜類、多酚、色素和蒽醌等化合物[9]。目前尚無雙水相體系提取水飛薊中水飛薊賓的研究報(bào)道。實(shí)驗(yàn)采用乙醇-硫酸銨雙水相體系與超聲法相結(jié)合，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選水飛薊中水飛薊賓提取工藝，為工業(yè)化提取水飛薊提供綠色環(huán)保工藝。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

水飛薊購自安徽亳州中藥飲片有限公司。水飛薊賓對(duì)照品（上海紫一試劑廠，純度≥98%，批號(hào)ZY141110）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC2010HT高效液相色譜儀，F(xiàn)A2004N型電子天平，KQ-600E型超聲波清洗器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙水相體系組成

一定濃度的乙醇溶液中加入定量的硫酸銨，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系。試驗(yàn)通過改變成相后乙醇與水的比例以及硫酸銨的用量來控制雙水相體系的形成[10]。

1.3.2 水飛薊賓的超聲提取與雙水相分離

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過脫脂處理的1 g水飛薊粉于100 mL具塞錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的硫酸銨，攪拌溶解后，在確定的超聲功率下超聲一定時(shí)間，超聲完畢后，過濾，濾液置于分液漏斗中靜置分層，上層清液為水飛薊乙醇提取液，提取液減壓濃縮至干，色譜甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中，用于測(cè)定粗提物中水飛薊賓含量。

1.3.3 水飛薊賓含量測(cè)定的色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸（48∶52∶1），流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按水飛薊賓峰計(jì)算不低于5 000[1]。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取水飛薊賓對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液。精密吸取水飛薊賓對(duì)照品溶液5，10，15，20，25 μL注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)水飛薊賓含量具有顯著影響的乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨用量、料液比和超聲時(shí)間4個(gè)因素為自變量，每個(gè)自變量確定5個(gè)水平，分別用代碼-α，-1，0，1，α（α=1.682）表示，共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 提取工藝因素水平編碼Table 1Factors and levels of response surface methodology test

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程

根據(jù)進(jìn)樣量及對(duì)應(yīng)的峰面積，得到回歸方程Y= 4 534 782.36X-782 563.2，r=0.999 9，表明水飛薊賓在0.60～3.00 μg與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 模型的建立與方差分析

運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，回歸模型方差分析見表3，得到的自變量與因變量間的回歸方程為：

表3中模型的F值為211.61，P＜0.000 1，表明該二次多元回歸模型極顯著?；貧w方程決定系數(shù)0.995 3，說明模型能解釋99.53%響應(yīng)值的變化，擬合情況良好。結(jié)果表明，一次項(xiàng)交互項(xiàng)及二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.000 1），交互項(xiàng)（對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)作用顯著（P＜0.05）。失擬項(xiàng)的P值為0.161 8，大于0.05，說明該模型擬合度好，試驗(yàn)誤差小，所建立的模型是可行的。

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2Design and results of response surface methodology test

表3 回歸模型方差分析Table 3Variance analysis results of regression model

續(xù)表3回歸模型方差分析Continued table 3Variance analysis results of regression model

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，在保持2個(gè)因素編碼值為0時(shí)，運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件繪制另2個(gè)因素與水飛薊賓含量關(guān)系的三維響應(yīng)面圖（圖1～6）。響應(yīng)面為響應(yīng)值對(duì)兩兩交互因素所構(gòu)成的三維空間曲線圖，效應(yīng)面曲線越陡峭，說明各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響越明顯。取回歸模型最大值點(diǎn)，X的代碼值分別為-0.38、-0.74、0.56、-0.76，對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)值乙醇體積分?jǐn)?shù)為57%，硫酸銨的用量為0.26 g·mL-1，料液比為25 mL·g-1，超聲時(shí)間為19 min，水飛薊賓含量為10.18 mg·g-1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨用量對(duì)水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.1Response surface plots of the effect of ethanol concentration and consumption of ammonium sulphate on the silymarin yield

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的工藝條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得到的水飛薊賓含量為10.18 mg·g-1（RSD 1.62%），與預(yù)測(cè)值10.16 mg·g-1相符，說明優(yōu)選的工藝條件重現(xiàn)性好，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好。在料液比均為25 mL·g-1的條件下，采用不同方法提取水飛薊賓，結(jié)果見表4。結(jié)果超聲輔助雙水相體系法與連續(xù)回流法、微波提取法、超聲提取法相比，具有省時(shí)、提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.2Response surface plots of the effect of ethanol concentration and sample/solvent ratio on the silymarin yield

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.3Response surface plots of the effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the silymarin yield

圖4 硫酸銨用量和料液比對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.4Response surface plots of the effect of consumption of ammonium sulphate and sample/solvent ratio on the silymarin yield

圖5 硫酸銨用量和超聲時(shí)間對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.5Response surface plots of the effect of consumption of ammonium sulphate and ultrasonic time on the silymarin yield

圖6 料液比和超聲時(shí)間對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的響應(yīng)面圖Fig.6Response surface plots of the effect of sample/solvent ratio and ultrasonic time on the silymarin yield

表4 不同提取工藝對(duì)水飛薊賓提取量的影響Table 4The effect of different extraction techniques on the silymarin yield

3 討論

采用超聲輔助雙水相體系，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)水飛薊中水飛薊賓的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為57%，硫酸銨的用量為0.26 g·mL-1，料液比為25 mL·g-1，超聲時(shí)間為19 min。在最佳提取條件下水飛薊賓的提取率可達(dá)到10.18 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇-硫酸銨雙水相體系具有溶劑價(jià)廉低毒易回收，避免使用高聚物等特點(diǎn)[12]，同時(shí)提高了水飛薊賓的提取率，操作簡(jiǎn)便，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。該研究結(jié)果為天然產(chǎn)物中有效成分的提取提供了一定的參考價(jià)值。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］Salehi M，Hasanloo T，Mehrabian S，et al.Effects of silybum marianum（L.）Gaertn seeds extract on dermatophytes and saprophytes fungi in vitro compare to clotrimazol［J］. Pharm Sci，2011，16：203-210.

［3］任冰如，趙友誼，徐柏衡.水飛薊素提取和水飛薊賓純化的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（3）：655-656.

［4］王小記，郎美琦.水飛薊賓的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用［J］.山西中醫(yī)，2014，30（7）：58-59.

［5］張淑麗，楊世海，張海弢，等.水飛薊有效成分及其提取方法研究進(jìn)展［J］.人參研究，2012，4：51-54.

［6］李朝陽，賈鵬禹，李良玉，等.超聲波輔助法提取黃苦蕎麥殼色素的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（5）：132-138.

［7］黃飛，屈飛強(qiáng)，任曉瓊.超聲波輔助提取分離菠菜色素的工藝研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（1）：64-68.

［8］李良玉，李朝陽，于偉，等.苦蕎麥殼總黃酮超聲波提取工藝研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（5）：87-92.

［9］劉磊磊，李秀娜，趙帥.雙水相萃取在中藥活性成分提取分離中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中草藥，2015，46（5）：766-774.

［10］李彩霞，高海寧，張喜峰，等.超聲輔助雙水相體系提取國(guó)槐葉黃酮［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（10）：1387-1391.

［11］滕坤，阮洪生，武子敬，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選藤梨根總皂苷提取工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（22）：26-28.

［12］丁霞，張?jiān)书瑮钤?，?丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮［J］.中成藥，2015，37（1）：231-233.

Optimization of Ultrasonic-assisted Aqueous Two-phase System Extraction Silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn

Ruan Hongsheng1，2，Jia Guiyan1，Wu Zhijun1，Zheng Xiaoliang1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Zhejiang Pharmaceutical College）

To optimize the extraction technology of silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn，the independent variables were ethanol concentration，consumption of ammonium sulphate，sample/solvent ratio and ultrasonic time，the dependent variable was extraction rate of silymarin which was used to estimate the relationship between independent and dependent variables.Central composite design and response surface methodology，accompanied by ultrasonic-assisted aqueous two-phase system，was used to optimize the process of extraction.The optimum technological parameters were as follows：ethanol concentration 57%，consumption of ammonium sulphate 0.26 g·mL-1，sample/solvent ratio of 25 mL·g-1，and ultrasonic time 19 min.The highest extraction rate of silymarin was 10.18 mg·g-1，which was coincided with model predictions.The extraction technology was simple，reliable and highly predictive which could be used for extraction of silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn.

aqueous two-phase system；Ultrasonic extraction；Silybum marianum（L.）Gaertn；Silymarin

R283.6

A

1002-2090（2017）01-0059-05

2016-03-08

黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項(xiàng)目（HNK125B-13-04）。

阮洪生（1973-），男，副教授，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事中藥學(xué)的教學(xué)與研究工作。