劉景雙 劉向群

肺炎克雷伯桿菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥機(jī)制

劉景雙1劉向群2

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae ，KP)為一種無(wú)自主能動(dòng)能力、有莢膜、兼性厭氧、乳糖發(fā)酵的革蘭陰性條件致病菌[1]，常常存在于人類的口腔、皮膚、腸道、尿道等部位[2]，可引起肺炎、尿路感染、腦脊膜炎、敗血癥、菌血癥、腹瀉等相關(guān)感染性疾病[3]。在抗生素不斷選擇、抗感染治療的時(shí)間延長(zhǎng)及抗生素選擇的劑量及手術(shù)操作等多方面因素影響下，多重耐藥肺炎克雷伯桿菌逐漸增多[4]，特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP) 的增多，給臨床醫(yī)生帶來(lái)的極大的挑戰(zhàn)。本文主要對(duì)CRKP的耐藥機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，以對(duì)臨床醫(yī)生抗生素的合理使用、促進(jìn)疾病的愈合及減少耐藥菌株的擴(kuò)散提供幫助。

CRKP的耐藥機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：產(chǎn)ESBLs、減少外膜的通透性、增加外排泵的外排作用[5]等。

ESBLs

ESBLs為β-內(nèi)酰胺酶的集合，可水解青霉素、頭孢菌素、單菌胺類等抗生素[6]。ESBLs的產(chǎn)生具有地域特性，并且與高發(fā)病率及高死亡率相關(guān)。最初的ESBLs的定義是根據(jù)其水解能力，之后發(fā)展為目前Amber分類的A、B、C、D類[7]。A類以絲氨酸殘基為活性位點(diǎn)，包括KPC、CTX--M、SHV1、TEM1、ROB1等；B類為金屬酶，以金屬離子為活性位點(diǎn)，目前最受關(guān)注的為新德里β-內(nèi)酰胺酶(NDM)；C類為頭孢菌素酶(Ampc)，同樣以絲氨酸殘基為活性位點(diǎn)；D類為青霉素酶(OXA)。原酶活性位點(diǎn)的突變會(huì)使其可水解的底物擴(kuò)增，這些酶在抗生素選擇的壓力下通過質(zhì)粒向外傳播，擴(kuò)大其耐藥的范圍[7]。其中與CRKP相關(guān)的ESBLs主要為A類中的KPC酶、B類中的NDM及D類中的OXA[8]，他們可不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，并可產(chǎn)生碳青霉烯酶活性。

一、產(chǎn)KPC酶

產(chǎn)KPC酶為KP對(duì)碳青霉烯類耐藥的最為常見的機(jī)制，在2001年，產(chǎn)KPC酶的KP菌株在卡萊羅納的北部被發(fā)現(xiàn)[5]，KPC酶分為KPC1-19共19種，其中最為常見的為KPC-2和KPC-3[9]，KPC酶為A類β-內(nèi)酰胺酶，在KP、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、變形桿菌、檸檬酸桿菌及沙門菌中均有發(fā)現(xiàn)。編碼KPC的基因由質(zhì)粒介導(dǎo)，且其側(cè)面由可移動(dòng)的基因片段填充，這就使得其可由質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至染色體，同樣可由染色體轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒[10]。國(guó)外的相關(guān)報(bào)道KPC編碼基因位于Tn4401的Tn3型轉(zhuǎn)座子上，這類轉(zhuǎn)座子可使基因插入不同的G-性細(xì)菌的不同質(zhì)粒，這與KPC酶的迅速擴(kuò)散相關(guān)[3，11]。在國(guó)內(nèi)的原始研究中顯示與國(guó)外不同，KPC-2基因位于Tn1721的Tn3型轉(zhuǎn)座子上，到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)攜帶KPC基因的Tn4401菌株[12-15]。KPC酶可使細(xì)菌對(duì)所有的β內(nèi)酰胺類抗生素均可耐藥，包括：青霉素類、頭孢類、單菌胺類及碳青霉烯類[16]，給臨床藥物的選擇帶來(lái)極大的困擾。因此有效的KPC檢測(cè)方法尚需進(jìn)一步去探索，提高對(duì)KPC檢測(cè)的敏感性，減少KPC基因的擴(kuò)散，可有效減少多重耐藥菌株的出現(xiàn)。

二、新德里β-內(nèi)酰胺酶(NDM-1)

NDM-1為一種新的具有碳青霉烯酶活性的金屬β-內(nèi)酰胺酶，2008年在KP中首次被發(fā)現(xiàn)[15]。NDM-1最先在KP及大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1由質(zhì)粒編碼，并可轉(zhuǎn)化結(jié)合到其他菌株，這可幫助其迅速在不同的菌種間播散，且blaNDM-1基因往往與其他耐藥決定因子相結(jié)合，這可大大增加其耐藥能力。在一些菌株中基因區(qū)域可以形成連續(xù)重復(fù)的復(fù)制，從而提高其復(fù)制的數(shù)量，促進(jìn)其基因的擴(kuò)散[17]。blaNDM-1基因在不同的質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn)，包括IncA/C、IncF、IncL/M等，IncN質(zhì)粒在臨床上同時(shí)編碼其他重要的耐藥基因，包括blaCTX-M、blaIMP、blaNDM、blaKPC[18]，這是各種酶類協(xié)同發(fā)揮耐藥作用的基因基礎(chǔ)，攜帶耐藥基因的質(zhì)粒在不同細(xì)菌間傳播，造成耐藥的流行，NDM目前發(fā)現(xiàn)同樣與多種亞型，如NDM-3及NDM-5等，但目前尚缺乏對(duì)其有效的檢測(cè)方法，尚需我們進(jìn)一步去探索。

三、OXA

OXA為一類具有碳青霉烯酶活性的苯唑西林酶，臨床上發(fā)現(xiàn)的OXA變種越來(lái)越多，并具有廣譜的水解活性。在CRKP中發(fā)現(xiàn)的有OXA-181、OXA-48、OXA-244、OXA-1等。有研究發(fā)現(xiàn)ISEcp1-OXA-181轉(zhuǎn)座子的3個(gè)復(fù)制片段在染色體從始至終均存在，其中一個(gè)片段可導(dǎo)致mgrB基因的失活(mgrB基因?yàn)閜hoPQ的負(fù)調(diào)控者)，而mgrB基因的失活會(huì)導(dǎo)致多粘菌素耐藥[19]。ISEcp1插入片段在blaCTX-M、blaCYM、blaACC中同樣有發(fā)現(xiàn)，這與blaOXA-181中的插入序列相似[20]，均可提高厄他培南、亞胺培南、美羅培南的MICs，產(chǎn)生耐藥性。2003年OXA-48首先在土耳其的臨床KP菌株中報(bào)道[21]，目前為止已在多種菌株中被發(fā)現(xiàn)。blaOXA-48基因廣泛擴(kuò)散在腸桿菌科中定位在64kb的結(jié)合質(zhì)粒上，屬于IncL/M中的一員。這種質(zhì)粒的特點(diǎn)是具有高轉(zhuǎn)移率及廣闊的宿主。他們的高共軛性可能是由于失活的TIR基因編碼接合性質(zhì)粒轉(zhuǎn)移抑制因子，通過插入復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn1991 / Tn1991、2 攜帶blaOXA-48-like基因[22],基因一旦形成，便可在不同的宿主間傳播，并可在抗生素不斷選擇的壓力下產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生不同的亞型。有研究顯示一些OXA的變種是由于其blaOXA-48基因編碼的一些氨基酸替換而導(dǎo)致酶的不同[23]。例如在西班牙發(fā)現(xiàn)的OXA-244與OXA-48的不同之處在于一個(gè)核苷酸的替換A640G，這就導(dǎo)致了一個(gè)氨基酸的替換Arg214Gly[23]。OXA-1在G-桿菌的質(zhì)粒及整合體中被發(fā)現(xiàn)，且其與CTX-M-15結(jié)合可對(duì)β-內(nèi)酰胺類與酶抑制劑的復(fù)合物產(chǎn)生耐藥[24]。

四、其他ESBLs

除了上述三種ESBLs外，在KP中尚有其他的ESBLs參與碳青霉烯類的耐藥，如CTX-M、TEM、SHV等[5]。CTX-M尤其在KP及大腸埃希菌中流行，多種遺傳機(jī)制為其提供了異型多樣性，也是其基因決定簇快速傳播的基礎(chǔ)。CTX-M型往往在院外播散，而在院內(nèi)則由TEM、SHV所取代[7]，而他們各亞型之間往往僅有點(diǎn)突變的不同。如SHV-31與SHV-1氨基酸序列的不同是由兩個(gè)點(diǎn)突變?cè)斐傻?，分別為L(zhǎng)35Q和E240K，SHV-31與SHV-12僅有一個(gè)點(diǎn)突變的不同。

外膜孔蛋白的突變

多個(gè)研究[6，19，24-25]中顯示在CRKP中均有外膜孔蛋白的突變，從而降低外膜對(duì)抗生素的滲透性。染色體編碼的外膜孔蛋白基因的突變備受關(guān)注，其中研究較為清楚的為Ompk35、Ompk36。Ompk36發(fā)生較大變化，其氨基酸序列的改變位于L3環(huán)上，L3環(huán)組成了孔蛋白的通道小孔，L3的改變與碳青霉烯類耐藥相關(guān)。另外，Ompk35插入IS序列導(dǎo)致Ompk35的失活[19]。有研究顯示OmpK35發(fā)生框移突變，這些突變包括一個(gè)堿基對(duì)的插入或是一個(gè)堿基對(duì)的刪除，亦或是一個(gè)氨基酸的替換，這導(dǎo)致基因區(qū)間的提前出現(xiàn)終止密碼子，從而使轉(zhuǎn)錄的肽鏈提前結(jié)束。Ompk36的突變修飾更是多變的，在Ompk36中插入的包含插入序列(IS)的兩條鏈破壞了開放閱讀框架區(qū)域，使終止密碼子提前出現(xiàn)，而使肽鏈的轉(zhuǎn)錄提前結(jié)束[26]。這與Sugumar M等的研究結(jié)果相似[24]。兩種孔蛋白各自對(duì)碳青霉烯耐藥的影響尚不明確，在KP中兩種孔道蛋白對(duì)產(chǎn)生碳青霉烯類耐藥均有作用[27]，單純Ompk35的丟失對(duì)耐藥影響較小，而Ompk36的丟失可以顯著增加產(chǎn)ESBL及AmpC細(xì)菌的青霉素及碳青霉烯類的MIC，兩者同時(shí)丟失則產(chǎn)生對(duì)大多數(shù)青霉素及碳青霉烯類的耐藥[23]。

外排泵的改變

增加外排泵對(duì)抗生素的外排作用是細(xì)菌對(duì)多數(shù)抗生素的共同耐藥機(jī)制，在KP中參與臨床相關(guān)抗藥性的外排泵大部分屬于抗藥小結(jié)分裂區(qū)(RND)家族，RND位于內(nèi)膜區(qū)，并且有廣泛的底物范圍，外排泵的內(nèi)膜結(jié)合蛋白決定了底物的特異性及廣泛性，可外排不同結(jié)構(gòu)的抗菌藥物。當(dāng)外排泵底物的抗生素作用于菌株時(shí)，可使外排泵基因表達(dá)增加，從而形成對(duì)此抗生素的耐藥。碳青霉烯類抗生素的使用不僅可造成細(xì)菌對(duì)其耐藥，同樣可造成細(xì)菌對(duì)其他藥物耐藥，如替吉環(huán)素、米諾環(huán)素等。在對(duì)CRKP的研究中發(fā)現(xiàn)，外排泵基因acrA、acrB、tolC、oqxA、oqxB表達(dá)增加，及外排泵調(diào)節(jié)因子acrR、marA、soxS、rarA、ramA表達(dá)增加。其中AcrAB-TolC系統(tǒng)及OqxAB系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[28]，AcrAB有廣泛的底物范圍，包括喹諾酮類、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、β內(nèi)酰胺類等，他們與Tolc相結(jié)合可增強(qiáng)其外排作用[29]。有研究顯示[30-32]，AcrAB-TolC系統(tǒng)的表達(dá)增加，與acrR的突變有關(guān)，acrR為AcrAB的抑制性調(diào)節(jié)因子，acrR的突變導(dǎo)致其失活，從而使其對(duì)外排泵的抑制作用減弱而使其表達(dá)增加。值得慶幸的是由外排泵表達(dá)增加所致的細(xì)菌耐藥可由外排泵抑制劑所逆轉(zhuǎn)[33]，這為我們臨床研究相關(guān)藥物提供契機(jī)。

總 結(jié)

值得注意的是單一的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)碳青霉烯類的抵抗作用是非常微弱的，他們需與其他的酶類或其他耐藥機(jī)制聯(lián)合作用，如產(chǎn)KPC酶與膜蛋白的突變相結(jié)合或外膜孔蛋白的突變與外排泵外排增加相結(jié)合，各種機(jī)制相互作用從而形成菌株對(duì)多種抗生素的耐藥，使我們?cè)谟邢薜目股孛媲懊媾R著巨大的選擇壓力，了解細(xì)菌耐藥機(jī)制的變化情況，根據(jù)細(xì)菌耐藥機(jī)制的變化選擇針對(duì)性藥物及為研制新藥提供方向，是我們接下來(lái)努力的方向。另外新的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生往往是在抗生素選擇壓力下細(xì)菌為生存所做出的改變，臨床合理選擇抗生素將有效減少細(xì)菌突變及減少超級(jí)耐藥菌的產(chǎn)生，這就要求我們除有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)外，較為敏感的耐藥菌檢測(cè)方法也是迫切需要的，目前各種實(shí)驗(yàn)方法還處在探索階段，為限制多重耐藥菌的擴(kuò)散，指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素，在新生抗生素研發(fā)出來(lái)前，對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制更為敏感的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法是非常有必要的，這也值得我們?nèi)ジ由钊氲奶剿鳌?/p>

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.044

1. 221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學(xué) 2. 221002 江蘇 徐州，徐州市第一人民醫(yī)院

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2016-10-20]