姚芳苡，黃自坤，熊國亮，彭亦平，李俊明，傅穎媛

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；3、江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；4、江西省胸科醫(yī)院內(nèi)二科，江西南昌330006)

·論著·

肺結(jié)核患者外周血單個核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的檢測及臨床意義

姚芳苡1，黃自坤2，熊國亮3，彭亦平4，李俊明2，傅穎媛1

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；3、江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006；4、江西省胸科醫(yī)院內(nèi)二科，江西南昌330006)

目的探討肺結(jié)核患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中長鏈非編碼RNA（lncRNA）核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1（NEAT1）的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時熒光定量PCR（RT－PCR）技術(shù)檢測65例肺結(jié)核病患者（結(jié)核組）及30例健康體檢者（健康對照組）PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)量，分析其與結(jié)核病發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。結(jié)果RT－PCR檢測結(jié)果顯示lncRNA NEAT1在肺結(jié)核患者PBMC中的相對表達(dá)水平是健康對照組的4.90±0.72倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LncRNA NEAT1在初治和復(fù)治病例中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；lncRNA NEAT1在肺部有無空洞及空洞數(shù)量分組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即lncRNA NEAT1隨空洞累及范圍的增加而升高。肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)量隨著治療時間逐漸下降，恢復(fù)至正常水平。結(jié)論肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)升高，且與肺結(jié)核的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)，監(jiān)測PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)或可以評估結(jié)核病患者預(yù)后情況。

結(jié)核病；LncRNA NEAT1；預(yù)后

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性感染性疾病。近年來由于耐藥菌株的不斷增多，治療難度越來越大，廣泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給抗癆治療提出新的挑戰(zhàn)[1]。長期的流行病學(xué)研究顯示，雖然結(jié)核菌感染人數(shù)眾多，但只有5%～10%的感染者發(fā)展為活動性結(jié)核病，機(jī)體的免疫系統(tǒng)在結(jié)核病的發(fā)病和發(fā)展中起了關(guān)鍵作用[2，3]。抗結(jié)核免疫主要依賴細(xì)胞免疫，但到目前為止，對結(jié)核免疫逃逸機(jī)制的了解還非常有限，這也是結(jié)核病難以有效控制的重要原因之一。

長鏈非編碼RNA（long non－coding RNA，lncR-NA)是一類長度超過200核苷酸的RNA分子，廣泛表達(dá)于真核生物體內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育等眾多的生物學(xué)進(jìn)程[4，5]。lncRNA NEAT1（核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1，nuclear enriched abundant transcript 1）是在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的一個lncRNA，它可與蛋白NONO相互作用，促進(jìn)了核內(nèi)旁斑的形成[6，7]。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1作為一種新的調(diào)控分子在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[8]。目前l(fā)ncRNA在結(jié)核病中的研究尚處于在起步階段，有關(guān)lncRNA NEAT1在結(jié)核病患者中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR（real－time quantitative PCR，RT－PCR）技術(shù)檢測肺結(jié)核患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)，觀察治療中以及治療后患者lncRNA NEAT1的表達(dá)變化，探討其在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料⑴結(jié)核組：收集2014年5月至2015年5月于江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科住院的結(jié)核病患者65例，其中男35例，女30例；年齡22～58歲，中位年齡34歲；初治40例，復(fù)治25例。所有肺結(jié)核患者均依據(jù)臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)或抗結(jié)核藥物治療明確診斷者，并經(jīng)結(jié)核分枝桿菌基因分型為結(jié)核分枝桿菌。診斷依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療手冊（結(jié)核病分冊）》診斷標(biāo)準(zhǔn)。⑵健康對照組：收集同期于江西省南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院保健科體檢者30例，其中男17例，女13例；年齡25～60歲，中位年齡36歲。胸部X透視檢查未見異常，近期無接觸結(jié)核病史者，經(jīng)PPD皮試結(jié)果為陰性。所有對象均排除合并腫瘤、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物的患者；排除孕婦或哺乳期婦女；排除HBV、HCV、HIV感染者或（和）AIDS患者。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。結(jié)核組及健康對照組2組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 主要試劑Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自美國sigma公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBRPremix Ex TaqTM均購自大連寶生物TaKaRa公司。

1.2.2 儀器分光光度儀購自美國Bio－Rad公司；Applied Biosystems 7600型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集及處理清晨空腹采集研究對象靜脈血5ml于肝素鈉抗凝管中，混勻備用。按常規(guī)方法用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC。

1.3.2 總RNA提取按Trizol試劑說明書提取PBMC總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用分光光度儀檢測總RNA濃度和質(zhì)量，檢測合格后于－80℃凍存待用。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄法反應(yīng)以GAPDH作為內(nèi)參照，分析lncRNA NEAT1的表達(dá)。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于－80℃凍存待用。

1.3.3 RT－PCR反應(yīng)采用SYBR法進(jìn)行RT－PCR檢測，檢測步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成：lncRNA NEAT1上游引物為：5'－CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC－3'，下游引物為5'－CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC－3'；內(nèi)參GAPDH上游引物為5'－GCACCGTCAAGG CTGAGAAC－3'，下游引物為5'－TGGTGAAGACGC CAGTGGA－3'。以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系為：1×SYBR Green I master－mix、0.5μmol/L特異前向引物、0.5μmol/L特異反向引物、1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10min，95℃15s，60℃1min，72℃30s，40循環(huán)。RT－PCR使用ABI 7600儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對定量法對RTPCR結(jié)果進(jìn)行分析，以2－△△Ct表示肺結(jié)核患者PBMC中目的基因的表達(dá)相對與健康對照組的變化倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核患者和健康對照者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平比較采用RT－PCR技術(shù)檢測65例肺結(jié)核患者和30例健康對照者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)差異。檢測結(jié)果顯示如圖1，肺結(jié)核組PBMC中的lncRNA NEAT1水平顯著高于對照組，為正常水平的4.90±0.72倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNANEAT1的相對表達(dá)量

2.2 不同肺結(jié)核組PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平比較根據(jù)肺結(jié)核患者既往抗結(jié)核治療的有無分為初治病例和復(fù)治病例，對上述患者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，初治和復(fù)治病例lncRNA NEAT1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A。根據(jù)肺結(jié)核患者肺部空洞的有無及空洞所占肺野數(shù)分為無空洞組、空洞1~2個肺野組、空洞3~4個肺野組以及空洞5~6個肺野組，結(jié)果顯示，隨著肺部空洞的增加，PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)量逐漸升高（P＜0.05），見圖2B。

圖2 不同肺結(jié)核組PBMC中l(wèi)ncRNANEAT1的相對表達(dá)量

2.3 肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1隨著抗結(jié)核治療時間的變化情況為了檢測lncRNA NEAT1在疾病治療過程中的動態(tài)變化能否反映抗結(jié)核治療的效果，我們對已收治的20例初治結(jié)核患者進(jìn)行6個月的隨訪，并按不同治療時間給予分組，比較分析了新發(fā)病例在未接受治療組、接受治療3月組和接受治療6月組3組間PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1的變化情況，結(jié)果顯示如圖3，隨著治療時間延長，lncRNA NEAT1表達(dá)量逐漸降低。與未接受治療組比較，接受治療3月組和6月組lncRNA NEAT1水平均顯著降低（P＜0.05）；接受治療6月組lncRNA NEAT1水平接近健康對照組水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 抗結(jié)核治療過程中l(wèi)ncRNANEAT1相對表達(dá)量的變化

3 討論

目前越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中均扮演著極其重要的角色[9]。近年，lncRNA在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用也開始引起人們的關(guān)注[10]。如Yi等[11]采用基因芯片技術(shù)檢測了外周血CD4+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在活動性肺結(jié)核患者、潛伏性結(jié)核感染者和健康對照者中，lncRNA有異常表達(dá)。最近有學(xué)者證實(shí)，T細(xì)胞抑制分子CD244通過誘導(dǎo)lncRNA CD244的表達(dá)，從表觀遺傳上控制了結(jié)核菌感染過程中CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[12]。我們近期研究證實(shí)，lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在結(jié)核感染過程中表達(dá)升高，且與結(jié)核的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)，下調(diào)MALAT1表達(dá)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)結(jié)核菌的清除能力[13]。

NEAT1是位于細(xì)胞核內(nèi)一種稱為旁斑的結(jié)構(gòu)上，對該結(jié)構(gòu)的形成和維持至關(guān)重要。隨著對lncRNA NEAT1研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1是一個長的多聚腺苷酸RNA轉(zhuǎn)錄本，且已有的研究證實(shí)，lncRNA NEAT1上調(diào)表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[14，15]。近期的研究證實(shí)，lncRNA NEAT1還參與了免疫調(diào)控，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)控作用。如，Zhang Q等[16]研究發(fā)現(xiàn)HIV-1感染可以提高lncRNA NEAT1的表達(dá)水平，高表達(dá)的lncRNA NEAT1可以調(diào)控未經(jīng)剪切的HIV-1轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后修飾。張飛飛等[17]發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1參與了Toll樣受體2（tolllike receptors 2，TLR2）介導(dǎo)的先天免疫調(diào)節(jié)，且選擇性地調(diào)控一組TLR2信號活化緩慢持續(xù)誘導(dǎo)的晚期反應(yīng)炎癥因子的表達(dá)。目前尚未見有關(guān)lncRNA NEAT1在結(jié)核病中的研究報道。

本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測了肺結(jié)核患者和健康對照者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)，結(jié)果表明，lncRNA NEAT1在肺結(jié)核組中表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。初、復(fù)治肺結(jié)核患者之間lncRNA NEAT1表達(dá)未見明顯差別。本研究中，根據(jù)肺結(jié)核患者肺部空洞的有無及空洞所占肺野數(shù)分為無空洞組、空洞1~2肺野組、空洞3~4肺野組以及空洞5~6肺野組。結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即NEAT1隨著空洞累及范圍的增加而升高。

本研究對部分初治肺結(jié)核患者隨訪6個月，期間患者嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療方案接受治療，均未接受放化療等其他治療，且患者抗結(jié)核治療效果良好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未接受治療組患者相比，lncRNA NEAT1在抗結(jié)核治療3個月時表達(dá)明顯下降（P＜0.05），且隨著治療時間延長，lncRNA NEAT1表達(dá)量逐漸降低。當(dāng)接受6個月抗結(jié)核治療后，隨訪患者lncRNA NEAT1表達(dá)量已下降至正常水平，與健康對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)顯著升高，與結(jié)核病嚴(yán)重程度相關(guān)，且其表達(dá)變化反映抗結(jié)核治療的療效，有望作為評估患者預(yù)后的檢測指標(biāo)。進(jìn)一步探究lncRNA NEAT1在結(jié)核病中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，將為結(jié)核病的診斷或治療提供新的靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significance of lncRNA NEAT1 in peripheral blood mononuclear cells from patients with tuberculosis

YAO Fangyi，HUANG Zikun，XIONG Guoliang，et al.Department of Immunology，F(xiàn)aculty of Basic Medical Science，Nan-chang Uniuersity，Nanchang 330006，China.

Objective To explore expression and significance of long non－coding RNA(lncRNA)nuclear enriched abundant transcript 1(NEAT1)in pulmonary tuberculosis(TB)patients.Methods The expressions of lncRNA NEAT1 in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in 65 hospitalized pulmonary TB patients，30 healthy controls were analyzed by real－time quantitative PCR(RT－PCR).Results The relative expression levels of lncRNA NEAT1 in TB patients were 4.90±0.72 times of that in healthy controls(P＜0.01).There were no significant differences between new cases and relapsed cases on the expression of lncRNA NEAT1 (P＞0.05).However，the expression of lncRNA NEAT1 were correspondingly higher when cavitation existed and when cavitation was increased in size(P＜0.05).The levels of lncRNA NEAT1 were gradually decreased down to normal upon the treatment pharmacotherapy.Conclusion The levels of lncRNA NEAT1 are increased in TB patients，and the levels of lncRNA NEAT1 had relations with the development and outcome of TB.The alterations of lncRNA NEAT1 in PBMC during the period of pharmacotherapy might be a potential indicator for the prognosis of TB.

Tuberculosis；LncRNA NEAT1；Prognosis

R521，R446.62

A

1674－1129(2017)01－0005－04

10.3969/j.issn.1674－1129.2017.01.002

2016-07-27；

2016-12-29)

國家自然科學(xué)基金項目（81560001）；江西省青年科學(xué)基金項目（20142BAB215057）；江西省科技支撐計劃項目（20151BBG70208）；江西省教育廳青年基金項目（GJJ14176）；江西省衛(wèi)生和計生委科技項目（20161018）

姚芳苡，女，1988年生，學(xué)士學(xué)位，技師，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)在職碩士研究生，主要研究方向：抗感染免疫。

黃自坤，男，1986年生，主管技師，E-mail:yfyhzk@163. com，主要研究方向：抗感染免疫；傅穎媛，女，1954年生，教授，E-mail:hqfyy@126.com主要研究方向：抗感染免疫。