周 珺，熊 英，龔 甜，李健雄

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

江西省水痘-帶狀皰疹病毒基因特征研究

周 珺，熊 英，龔 甜，李健雄

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的了解江西省2010至2013年流行的水痘-帶狀皰疹病毒的基因型別。方法選取2010年至2013年南昌市的水痘-帶狀皰疹臨床診斷病例，采集皰疹液和（或）咽拭子標(biāo)本，提取水痘病毒DNA，對病毒基因組的ORF22區(qū)及ORF68區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測序和分析，將測序結(jié)果與GeneBank的VZV參考株的基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果采集到的84份標(biāo)本中共有55份檢測到水痘-帶狀皰疹病毒核酸；ORF22區(qū)的測序結(jié)果經(jīng)與水痘帶狀皰疹病毒J基因型的代表株p-Oka株及水痘疫苗代表株v-Oka株的基因序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)6個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)完全相同；對ORF68區(qū)的測序結(jié)果進(jìn)行比對并未發(fā)現(xiàn)任何突變。結(jié)論江西省2010-2013年流行性的水痘-帶狀皰疹病毒均為J基因型。

水痘－帶狀皰疹病毒（VZV)；測序；基因型

水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)是引起常見疾病水痘及帶狀皰疹的病原體，初次感染人體可引起水痘，而后可以長期潛伏在人體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，病毒會再度感染人體，形成帶狀皰疹。此外，水痘是一種常見的兒童呼吸道傳染病，每年在全世界引起大量的兒童發(fā)病。

VZV是一種DNA病毒，全基因組共12.5萬個(gè)堿基，71個(gè)開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，編碼80個(gè)蛋白質(zhì)。VZV只有一個(gè)血清型[1]，但不同毒株之間在基因序列上存在差異。近年來從基因水平上來探討不同VZV毒株之間的差異并通過基因序列分析來對病毒進(jìn)行分型成為國際上VZV研究的熱點(diǎn)[2]。本研究將選取水痘-帶狀皰疹病毒基因組中的ORF22及ORF68區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增及序列分析，通過與水痘-帶狀皰疹病毒的幾種基因型代表株對應(yīng)區(qū)域的序列進(jìn)行比對，確定我省近幾年流行的水痘-帶狀皰疹的主要基因型。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源從2010年至2013年，在江西省兒童醫(yī)院及南昌市高新區(qū)醫(yī)院選擇臨床診斷為水痘或帶狀皰疹的病人采集皰疹液和（或）咽拭子標(biāo)本，共84份，所有標(biāo)本采集后均置于-70℃冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑與儀器主要試劑：DNA提取試劑盒QIAmp DNA Mini kit（德國Qiagen公司，51306），DNA擴(kuò)增試劑盒GoTaq Green Master Mix (Promega公司，0000031171），水痘病毒減毒活疫苗（長春祈健生物制品有限公司，201301008），瓊脂糖（上海生工，AB0016H-250G），GOLD VIEW染料（Solarbio，G8140）。

主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀PTC-200（美國Bio-Rad），凝膠電泳儀（北京六一），全自動凝膠成像儀（VILBER LOURMAT）。

1.2.2 PCR擴(kuò)增按照QIAmp DNA Mini kit試劑盒的說明書操作對原始標(biāo)本提取病毒核酸，使用特異性引物擴(kuò)增病毒基因組的ORF22及ORF68區(qū)，引物序列：ORF22區(qū)引物F：GGGTTTTGTATGAGCGT TGG，R：CCCCCGAGGTTCGTAATATC[3]；ORF68區(qū)引物F：AGAACGCACACGAACACCAT，R：TCCGCT TCCTTCTTACCTTG[4]。擴(kuò)增體系按擴(kuò)增試劑盒試劑說明書操作；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。取水痘疫苗以同樣的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，作為對照。取擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，1.5%瓊脂糖凝膠在120V電泳30min，在自動凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.2.3 產(chǎn)物序列測定和分析對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定（由上海生工公司完成）。核苷酸序列采用DNAStar5.0、Mega5.2序列分析軟件進(jìn)行分析；與在GenBank中收錄的E基因型代表株歐洲水痘代表株Dumas株（GenBank NO.X04370），J基因型代表株日本流行株p-Oka株（GenBank NO.AB097933）、疫苗推薦代表株v-Oka株（GenBank NO. AB097932）及M2基因型代表株DR株（GenBank NO.DQ452050）的序列進(jìn)行比對。

圖2 21份標(biāo)本中病毒與各基因型代表株核苷酸序列比較示意圖

2 結(jié)果

2.1 原始標(biāo)本檢測結(jié)果所有84份原始標(biāo)本經(jīng)ORF22區(qū)引物擴(kuò)增（擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為447bp）瓊脂糖凝膠電泳后共檢測到55份陽性；ORF68區(qū)引物（擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為498bp）的檢測結(jié)果與ORF22區(qū)引物的檢測結(jié)果完全相同。

2.3 序列分析結(jié)果ORF22區(qū)測序比對結(jié)果：對所有擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物進(jìn)行測序，但因?yàn)橛行┊a(chǎn)物濃度不夠，最后得到21份不同標(biāo)本中病毒ORF22區(qū)的部分核苷酸序列。參考株J基因型p-Oka株及v-Oka株在37902、38019、38055、38081、38177、38229這6個(gè)位點(diǎn)的堿基分別為G、G、C、C、A、A，而這21份標(biāo)本在這6個(gè)位點(diǎn)的堿基與參考株完全一致（見圖2黑框處），說明這21份標(biāo)本中的病毒皆為J基因型。

ORF68區(qū)測序比對結(jié)果：對所有擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物進(jìn)行測序，但因?yàn)橛行┊a(chǎn)物濃度不夠，最后得到24份不同標(biāo)本中病毒ORF68區(qū)的部分核苷酸序列。所測得的24個(gè)ORF68部分區(qū)域的核苷酸序列與Dumas株和Oka株序列完全一致，即表明這些VZV的糖蛋白E未發(fā)現(xiàn)類似北美2MSP株或2BC株的堿基突變。

3 討論

水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-Zoster Virus，VZV），又稱3型人類皰疹病毒，是水痘及帶狀皰疹的病原體，在初次感染人體時(shí)癥狀通常表現(xiàn)為皮膚上出現(xiàn)含有液體的皰疹即為水痘，而病毒在原發(fā)感染后能潛伏在宿主的感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)病毒可再次激活可以引起疼痛性的皮膚疾病即帶狀皰疹[5]。

VZV的基因組為DNA，有12.5萬個(gè)堿基，但只有一個(gè)血清型。近年來，國際上多通過對病毒的基因序列進(jìn)行分析來對病毒進(jìn)行基因分型。經(jīng)過許多科學(xué)家的研究，發(fā)現(xiàn)VZV的基因組中有許多SNP位點(diǎn)，通過不同的排列組合，可以將VZV分為若干個(gè)基因型。SNP即單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide Polymorphism，SNP），而SNP位點(diǎn)是指基因組DNA中因?yàn)閱蝹€(gè)核苷酸變異引起的DNA序列的改變，包括轉(zhuǎn)換、插入、缺失等多種形式，但這種單個(gè)核苷酸變異在群體中發(fā)生的頻率要大于1%時(shí)才能被認(rèn)為是SNP[6]，以免一些罕見的基因突變被認(rèn)為是SNP。在以往的研究中已經(jīng)從VZV基因組中發(fā)現(xiàn)了至少58個(gè)SNP位點(diǎn)[7]。Loparev VN等[8，9]在對病毒ORF22區(qū)的基因進(jìn)行測序分析后發(fā)現(xiàn)病毒基因組中的ORF22區(qū)在37837-38283位點(diǎn)之間有6個(gè)點(diǎn)可準(zhǔn)確的將病毒分為E、J、M1和M2等幾個(gè)基因型。這6個(gè)位點(diǎn)分別為37902、38019、38055、38081、38177和38229；其中E基因型在這6個(gè)位點(diǎn)的堿基依次為A、G、T、A、G、A，代表株為Dumas株；J基因型在這6個(gè)位點(diǎn)則依次為G、G、C、C、A、A，代表株為p-Oka株；M1基因型在這6個(gè)位點(diǎn)依次為A、G、T、C、G、A，代表株為CA123株；M2基因型則又分為3個(gè)亞型，也是依據(jù)這6個(gè)位點(diǎn)的堿基不同而進(jìn)行分型。

本研究所采集的標(biāo)本經(jīng)在ORF22特定區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序并與參考株進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)：本次研究所采集的標(biāo)本中的VZV病毒均為J基因型。因水痘-帶狀皰疹病例的臨床癥狀較典型，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)確診率的幾率低，且目前未被列入我國的法定報(bào)告?zhèn)魅静。蚀宋覈腣ZV研究較少，各地流行的基因型也不太明確。在筆者查到的文獻(xiàn)中，有Loparev VN等[8]2004年從中國的南方(廣東等地)收集的3份標(biāo)本中的病毒為M基因型，從中國北方(山東等地)收集的3份標(biāo)本中的病毒為E基因型；楊吉星等[10]2008年收集的上海地區(qū)1份標(biāo)本及李崇山[4]等2009年收集的3份標(biāo)本中病毒的基因型均為J基因型；周小勇等[11]2009年收集的武漢地區(qū)78株VZV基因型也為J基因型；馬睿等[12]2009-2010年收集的寧波地區(qū)15份標(biāo)本中有13株VZV為J基因型，另2株為M1基因型；王艷等[13]2012年在遼寧省收集到的3份臨床標(biāo)本中的病毒均為J基因型；陳婷婷等[14]在福建省2011-2012年收集的44份VZV毒株也均為J基因型；甘霖等[15]在合肥地區(qū)收集的44株毒株也均為J基因型。本研究首次在江西省連續(xù)收集水痘的臨床標(biāo)本對其中的病毒進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)近幾年在江西省流行的VZV也都為J基因型。綜合文獻(xiàn)查閱的結(jié)果可見，我國近年來大部分地區(qū)流行的VZV基本都為J基因型，可能也有E和M基因型的流行。此外，曾有研究通過對ORF68區(qū)域的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)北美株2MSP和2BC中有點(diǎn)突變[4]，而本研究沒有發(fā)現(xiàn)類似的該突變。要充分掌握我國VZV的流行趨勢及分子進(jìn)化方向，有待更多的研究者在全國更為廣泛的地區(qū)收集更多的標(biāo)本，進(jìn)行持續(xù)而更加全面的研究。

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Varicella Zoster Virus Gene Characteristics of Jiangxi province

ZHOU Jun，XIONG Ying，GONG Tian，LI Jianxiong.Center for Disease Control and Prevention of Jiangxi Province，Nanchang 330029，China.

Objective To understand the genotype of varicella zoster virus(VZV)in Jiangxi province from 2010 to 2013. Methods The herpes fluid and/or throat swab specimens were collected from 84 patients clinically diagnosed with varicella zoster in Nanchang from 2010 to 2013，extract DNA from the specimens，amplify ORF22 area and ORF68 area of the virus genome，sequencing，analyze，and compare the sequencing results with VZV reference strains gene sequences in GeneBank.Results There are 55(65.48%)specimens have been detected varicella zoster virus nucleic acid；the sequencing results of ORF22 area compared with representative strains p-Oka and v-Oka of J genotype were found the 6 key sites are exactly the same；the sequencing results of ORF68 area have been found no mutation.Conclusion The epidemic genotype of varicella zoster virus in Jiangxi province from 2010-2013 is J type.

Varicella zoster virus(VZV)；Sequencing；Genotype

R752.1+2，Q523，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0014-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.004

2016-08-11；

2017-01-11)

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃課題，編號：20112001；本研究為國家“十一五”科技重大專項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”課題《湖北及周邊省傳染病病原譜流行規(guī)律研究》（2009ZX10004-207）的子課題。

周珺，1985年生，主管技師，主要從事病毒病原學(xué)的研究。E-mail：94396465@qq.com