程態(tài)英，李晨陽(yáng)，羅 云

(1、深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院體檢中心，廣東深圳518109；2、深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518054)

戊型肝炎病毒ORF3介導(dǎo)的IL-6及STAT3的表達(dá)

程態(tài)英1，李晨陽(yáng)2，羅 云1

(1、深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院體檢中心，廣東深圳518109；2、深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518054)

目的戊型肝炎病毒ORF3蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)中的功能尚未確定，本研究對(duì)其是否激活STAT3分子及作用進(jìn)行探討。方法采用前期已構(gòu)建的pEGFP-ORF3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；熒光定量PCR方法檢測(cè)各組IL-6及STAT3的mRNA表達(dá)量；ELISA法檢測(cè)各組上清中IL-6的分泌量；Western blot檢測(cè)各組STAT3的蛋白表達(dá)。結(jié)果和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組IL-6以及STAT3 mRNA水平明顯升高，培養(yǎng)上清中IL-6分泌增加，STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，但p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著增加。結(jié)論HEV引起的病毒性肝炎中，ORF3介導(dǎo)的STAT3及IL-6起著重要的作用。

戊型肝炎病毒；開(kāi)放閱讀框3；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；白介素6

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)感染引起的腸道傳染??；HEV是大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家引起急性病毒肝炎的重要病原體之一，是一種人畜共患疾病[1~3]。HEV發(fā)現(xiàn)時(shí)間較晚，直至1989年才獲正式命名；HEV是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒，基因全長(zhǎng)7.2～7.6kb，含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frames，ORFs)即ORF1、ORF2、ORF3。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒RNA復(fù)制及合成有關(guān)；ORF2是衣殼基因；ORF3基因片段長(zhǎng)369 bp(5103～5472)，位于病毒基因組3′端，與ORF1和ORF2都有部分的重疊，ORF3編碼含123個(gè)氨基酸約14kD大小的蛋白，且ORF3的起始端含有Met密碼子，可以獨(dú)立編碼多肽。ORF3蛋白的功能尚未確定，可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫應(yīng)答方面起著非常重要的作用。

STAT蛋白家族是一組重要的信號(hào)通路分子，目前已發(fā)現(xiàn)7種STATs，以STAT3的研究最為深入[4]。研究表明HEV基因ORF2和ORF3部分序列所編碼的蛋白能有效激發(fā)分泌IFN-γ的T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[5]，且戊肝急性期IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子表達(dá)明顯增高。這些細(xì)胞因子是否激活JAK/STAT3信號(hào)通路，及ORF3在激活JAK/STAT3中是否發(fā)揮作用目前都不知曉。因此，本研究將通過(guò)前期已構(gòu)建pEGFP-ORF3真核表達(dá)載體，對(duì)HEV ORF3是否激活STAT3分子及作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑前期構(gòu)建載體的HEV病毒分離自患者糞便，經(jīng)鑒定基因型分別為I型和Ⅳ型；pEGFP-N1載體、HepG2細(xì)胞等由本室保存。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海Beyotime生物技術(shù)研究所；Trizol試劑購(gòu)于北京達(dá)科為公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermantas；qRT－PCR試劑購(gòu)自BioRad；STAT3，p－STAT3抗體、內(nèi)參和二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；IL－6 ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1d，以4×105細(xì)胞/孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)16h后細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合。每種質(zhì)粒DNA取2.0μg，在1.5ml Ep管中用Opti－MEM培養(yǎng)基稀釋至總體積50μl。取3.0μl LipofectamineTM2000用Opti－MEM培養(yǎng)基稀釋至總體積50μl，室溫放置5min。將上述質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體混合，室溫放置20min，用PBS及無(wú)血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基分別洗細(xì)胞1次。每孔加入無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基0.4ml，將DNA/脂質(zhì)體混合物分別加人到各孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)。6h后換DMEM完全培養(yǎng)基，36h后收集細(xì)胞。

1.3 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL－6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，參照使用說(shuō)明書(shū)用Trizol法抽提總RNA。將RNA樣本用MMLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存在－80℃。

并利用Primer2.0及Primer－Blast設(shè)計(jì)待測(cè)基因的引物（表1）用于qRT－PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)量。所采用的qRT－PCR體系為20μl，其中2×SYBR Premix 10μl，Primers 0.2μmol/L，cDNA 0.5μl；qRT－PCR循環(huán)條件如下：95℃變性2min，后以94℃變性15s，55℃退火15s，40個(gè)循環(huán)；采用△△Ct法計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)變化。使用BioRad CFX manager 2.0分析不同感染狀態(tài)下基因的差異表達(dá)情況。

1.4 ELISA檢測(cè)各組上清中IL－6分泌水平收集各組上清液，－20℃保存，測(cè)定前置室溫復(fù)融，混勻，4℃3000r/min離心5min，取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)IL－6的表達(dá)。

1.5 Western Blot檢測(cè)各組STAT3和p－STAT3蛋白表達(dá)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1000r/min離心10min收集細(xì)胞，超聲粉碎后4℃12000r/min離心20min，取少量用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取25ug蛋白經(jīng)100g/L SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將剪好大小的PVDF膜放入甲醇溶液中10s激活，然后將PVDF膜和厚濾紙一起浸入半干轉(zhuǎn)緩沖液中，室溫浸泡30min；參照蛋白Marker切取所需目的蛋白所在的分離膠，浸入半干轉(zhuǎn)緩沖液中；采用恒壓20V轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)移結(jié)束后加入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBS－T溶液)，平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上于室溫溫育1h，加入一抗，置于4℃搖床過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)蛋白表達(dá)。用成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣木均數(shù)比較采用單因素方差分析(組間兩兩比較用Bonferroni法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組IL－6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒兩組對(duì)照組之間，IL－6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05，n=6)。轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組和對(duì)照組相比較，IL－6以及STAT3 mRNA水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=6)（見(jiàn)圖1）。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組IL-6以及STAT3 mRNA表達(dá)水平

2.2 各組IL－6分泌水平未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒兩組對(duì)照組之間，IL－6白介素分泌水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05，n=6)。轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組和對(duì)照組相比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL－6以分泌水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=6)（見(jiàn)圖2）。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組IL-6分泌水平

2.3 各組STAT3和p－STAT3蛋白表達(dá)水平未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒兩組對(duì)照組之間，STAT3及p－STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05，n= 6)。轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組和對(duì)照組相比較，STAT3蛋白表達(dá)水平也無(wú)顯著性差異（P＞0.05，n=6)，但p－STAT3蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異（P＜0.05，n=6)（見(jiàn)圖3）。

圖3 各組STAT3/p-STAT3蛋白表達(dá)水平

3 討論

HEV是大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家引起急性病毒肝炎的重要病原體之一，人類(lèi)在密切接觸家禽或食用未經(jīng)充分烹飪的動(dòng)物內(nèi)臟和肌肉后可以感染HEV[1，2]。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民群眾生活水平和衛(wèi)生素養(yǎng)提高，以及疫苗的使用等原因，霍亂、甲肝等腸道傳染病報(bào)告病例數(shù)呈逐年下降態(tài)勢(shì)，但同為主要通過(guò)糞－口途徑傳播的戊肝疫情卻一直呈緩慢上升態(tài)勢(shì)。在我國(guó)成年人急性病毒性肝炎中戊肝已占首位，人畜共患已成為我國(guó)戊肝的主要傳播模式[6－9]。同時(shí)，戊肝有與其他肝炎不同的流行特點(diǎn)，即重型病例多，易發(fā)生肝功能衰竭[10]。其發(fā)病機(jī)制可能與病毒直接損傷肝細(xì)胞和免疫損傷相關(guān)，但其具體致病機(jī)制不明。HEV含3個(gè)ORF，其中ORF3蛋白含有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，C末端的脯氨酸豐富區(qū)存在可與SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的PXXP基序，可能通過(guò)激活信號(hào)通路，影響基因的轉(zhuǎn)錄速度和表達(dá)水平來(lái)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡等多種過(guò)程[11，12]。杜麗等人研究了戊型肝炎病毒ORF3蛋白對(duì)于靶細(xì)胞MAPK磷酸化的影響，結(jié)果表明ORF3蛋白影響了HEK293細(xì)胞的p－Akt2、p－Aktpan、p－ERK1、p－ERF2、p－RSK1等MAPKs的磷酸化水平[13]；許劍等人研究發(fā)現(xiàn)，基因Ⅰ型戊型肝炎病毒ORF3抑制TNF－α誘導(dǎo)的NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)[14]。周嘉嘉等人研究表明，丙型肝炎病毒核心蛋白通過(guò)活化STAT3通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。這些研究均提示，ORF3在戊肝的發(fā)展中起著重要作用，而且和STAT3等信號(hào)通路相關(guān)。

STAT蛋白家族是一組可以被許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其它刺激所激活的信號(hào)通路分子，以STAT3的研究最為深入[4]。STAT3是一種存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號(hào)通道偶聯(lián)的雙功能蛋白。受到刺激后，STAT3在一個(gè)特定的酪氨酸位點(diǎn)（Tyr705）發(fā)生磷酸化，激活的STAT3形成同源或異源二聚體而轉(zhuǎn)移至胞核，然后與特定的啟動(dòng)基因結(jié)合，如早期即刻基因c－fos和jun－B啟動(dòng)基因等[16，17]。IFN－γ、IL－6、IL－10的信號(hào)傳導(dǎo)都需要STAT的參與，根據(jù)靶組織的不同，STAT3激活的結(jié)果可以是增殖、存活或者凋亡。IL－6家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均主要依賴(lài)于STAT3，且均受細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)調(diào)控，但對(duì)SOCS3的調(diào)控敏感性不同[18]。我們本次研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組和對(duì)照組相比較，IL－6的mRNA及上清中表達(dá)水平均明顯升高，STAT3的mRNA水平都較對(duì)照組增高，差異有顯著性意義。說(shuō)明IL－6及STAT3在ORF3引起的肝損傷中起著重要作用。但是在蛋白表達(dá)水平，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間，STAT3及p－STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。轉(zhuǎn)染I型和Ⅳ型ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組和對(duì)照組相比較，STAT3蛋白表達(dá)水平也無(wú)顯著性差異，但p-STAT3蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在ORF3引起的肝損傷中STAT3是通過(guò)磷酸化的方式發(fā)揮作用。

IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴(lài)于STAT3的參與[19]。IL-6與其膜受體結(jié)合后，激活STAT3，使其二聚化進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)多種基因轉(zhuǎn)錄活化，啟動(dòng)多種效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等。IL-6、STAT3在HBV及HCV等引起的急性肝炎中所起的作用有很多的報(bào)道[20，21]，但I(xiàn)L-6在HEV引起的戊肝中的作用機(jī)制還不清楚。我們研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6的mRNA及上清中表達(dá)水平均明顯升高，和Pradip B.Devhare[22]等研究的結(jié)果相一致，但和Lei Q等研究結(jié)果不一致[23]，分析可能的原因是：第一，IL-6在多種疾病及疾病的不同階段表達(dá)不一致，與疾病的進(jìn)展相關(guān)；第二，選擇不同的細(xì)胞系對(duì)ORF3的表達(dá)產(chǎn)生影響；第三，Lei Q在實(shí)驗(yàn)前用LPS進(jìn)行了共同刺激所引起；因此，IL-6在戊肝中的作用還需進(jìn)一步研究。在HEV引起的戊肝中，推測(cè)可能是肝內(nèi)IL-6的增加，引起STAT3的活化，活化的STAT3引起識(shí)別受體的進(jìn)一步活化，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起IL-6表達(dá)增加，形成持續(xù)的肝臟損傷狀態(tài)，是否存在這種正反饋循環(huán)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本文研究證明，在HEV引起的戊肝中，ORF3介導(dǎo)的STAT3及IL-6起著重要的作用，同時(shí)，ORF3、STAT3及IL-6可能會(huì)成為急性戊肝治療的潛在靶點(diǎn)。本文將為進(jìn)一步深入研究HEV的致病及防治機(jī)制提供了一個(gè)新的思路。

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Expression of STAT3 and IL-6 mediated by ORF3 of hepatitis E virus

CHENG Taiying，LI Chenyang，LUO Yun.1.Medical Examination Center，Longhua District Central Hospital，Shengzhen Guangdong 518109，China；2.Shenzhen University Health Science Center，Shengzhen Guangdong 518054，China.

Objective The functions of hepatitis E virus ORF3 protein in signal transduction has not been determined，this study was to investigate whether STAT3 molecule is activated and plays its role.MethodsThe eukaryotic expression vector EGFP-ORF3 which previously constructed was transfected into HepG2 cells；The lever of interleukin 6(IL-6)/signal transducers and activators of transduction 3(STAT3)transcription and cytokine IL-6 secretion in different groups was compared using qRTPCR and ELISA respectively.The protein expression of STAT3 was detected using Western blot.Results The lever of IL-6/ STAT3 transcription and IL-6 secretion in the experimental group was significantly higher than control.There was no significant difference in the expression of STAT3 protein levels，but a significant increase in p-STAT3.Conclusion Expression of STAT3 and IL-6 mediated by ORF3 of hepatitis E virus plays an important role in the E hepatitis.

Hepatitis E virus；ORF3；STAT3；IL-6

R446.62，R373.2

A

1674-1129(2017)01-0028-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.008

2016-08-10；

2017-01-13)

深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目資助（20140613100）

程態(tài)英，1974年生，女，副主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事病原微生物感染檢測(cè)及機(jī)制研究，TEL:0755-28011765。