葉 菁 蔣雪薇 羅曉明 周尚庭

揚(yáng)子江2 蔣小紅2 黎耀波2

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600)

高蛋白酶酶活醬油發(fā)酵用米曲霉的復(fù)合誘變選育

葉 菁1蔣雪薇1羅曉明1周尚庭2

揚(yáng)子江2蔣小紅2黎耀波2

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600)

以市售曲精分離菌株米曲霉CS3.03為出發(fā)菌株，經(jīng)UV—DES復(fù)合誘變處理，采用酪素平板法及瓊脂塊法進(jìn)行初篩，結(jié)合Folin—酚法復(fù)篩結(jié)果對(duì)比其初篩效果，低鹽固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)試高蛋白酶酶活突變株的發(fā)酵性能，傳代試驗(yàn)測(cè)試其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明：瓊脂塊法的初篩效率明顯高于酪素平板法；對(duì)初篩菌株進(jìn)行制曲復(fù)篩，獲得5株有生產(chǎn)潛力的高蛋白酶酶活突變株，醬油發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果證明突變株氨態(tài)氮含量、全氮利用率均高于出發(fā)菌，其中突變株P(guān)7、Y5發(fā)酵制得醬油氨態(tài)氮含量分別提高14.56%，11.26%，全氮利用率分別提高3.83%，4.09%；遺傳穩(wěn)定性測(cè)試證明P7具有良好工業(yè)應(yīng)用價(jià)值且遺傳穩(wěn)定性好，其蛋白酶酶活平均為4 994.18 U/g 干基，比出發(fā)菌株提高173.92%。

米曲霉；蛋白酶酶活；復(fù)合誘變；平板初篩；醬油發(fā)酵

米曲霉是醬油發(fā)酵的主要微生物，其分泌的蛋白酶能夠降解原料中的蛋白質(zhì)，生成氨基酸、多肽等小分子物質(zhì)[1]。氨態(tài)氮含量是醬油分級(jí)的主要指標(biāo)，米曲霉的酶活大小直接影響到醬油原料蛋白質(zhì)的降解程度，進(jìn)而影響到醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此，米曲霉蛋白酶高產(chǎn)株的篩選一直是醬油發(fā)酵菌種選育的重點(diǎn)。早在20世紀(jì)60年代，學(xué)者[2]就以A.S.3.863為母株進(jìn)行紫外誘變獲得了酶活高的滬釀3.042。其后，采用物理誘變、化學(xué)誘變以及復(fù)合誘變等方式提高米曲霉的蛋白酶酶活的研究也層出不窮。邵偉等[3]通過(guò)紫外與化學(xué)復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)蛋白酶菌株A11，其蛋白酶活由原始的3 447 U/g提高到3 668 U/g。近年來(lái)出現(xiàn)了一些新的菌株改造手段，如離子注入技術(shù)[4]、原生質(zhì)融合技術(shù)[5]、基因調(diào)控技術(shù)[6-7]等。但離子注入技術(shù)設(shè)備昂貴、操作難度大[8]，而基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)改造的食品用菌中存在著安全風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，因此誘變選育一直是醬油用米曲霉發(fā)酵性能提升的主要方法。

育種中采用科學(xué)的篩選方法是定向高效獲得高酶活突變株的關(guān)鍵。醬油發(fā)酵用的米曲霉突變株大多選用酪素培養(yǎng)基進(jìn)行平板初篩，通過(guò)水解圈和菌落直徑比值(K值)的大小反應(yīng)蛋白酶活力的大小[9]。由于米曲霉在平板上常形成形狀不規(guī)則菌落，導(dǎo)致利用K值篩選準(zhǔn)確度低，誤差大；此外，K值相近的菌株無(wú)法在平板初篩中判斷出蛋白酶酶活的高低[10]。瓊脂塊法[11]可以選擇厚度一致的瓊脂及生長(zhǎng)均勻的菌落打孔，減少了平板初篩中培養(yǎng)基用量及菌種數(shù)量的影響，可使平板初篩的結(jié)果更為接近搖瓶初篩結(jié)果，提高篩選的準(zhǔn)確性并減少篩選的工作量。本試驗(yàn)以醬油曲精分離菌株為出發(fā)菌，采用紫外—硫酸二乙酯(Ultraviolet-Diethyl sulfate，UV—DES)復(fù)合誘變處理，結(jié)合Folin—酚法復(fù)篩結(jié)果，對(duì)比分析酪素平板法與瓊脂塊法的初篩結(jié)果，篩選出一株適用于醬油發(fā)酵米曲霉高蛋白酶酶活突變株，并應(yīng)用于醬油發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

米曲霉(Aspergillusoryzae)：CS3.03，長(zhǎng)沙理工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)從市售迪發(fā)牌醬油曲精中分離純化并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與篩選平板

斜面培養(yǎng)基：PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基[12]；

酪素培養(yǎng)基：干酪素4 g，磷酸二氫鉀 0.36 g，硫酸錳 0.5 g，氯化鋅 0.014 g，磷酸氫二鈉 1.07 g，氯化鈉 0.16 g，硫酸亞鐵0.002 g，氯化鈣 0.002 g，去氧膽酸鈉1.0～2.0 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～7.0；

酪素—瓊脂雙層培養(yǎng)基：上層為酪素培養(yǎng)基，下層為純瓊脂培養(yǎng)基；

制曲培養(yǎng)基：豆粕 21 g，小麥6 g，麩皮3 g，水27 mL。

1.1.3 儀器

磁力攪拌器：79-2型，金壇市普瑞斯機(jī)械有限公司；

酸度計(jì)：FE28 型，瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；

紫外分光光度計(jì)： Blue Star 型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將CS3.03培養(yǎng)2～3 d至孢子成熟，紫外誘變時(shí)采用0.85%的無(wú)菌生理鹽水洗脫，DES誘變時(shí)采用pH 7.0 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液洗脫，再制成107CFU/mL 的孢子懸液備用。

1.2.2 UV誘變致死率曲線(xiàn)的測(cè)定 取10 mL孢子懸液至無(wú)菌平皿中，攪拌狀態(tài)下，進(jìn)行不同劑量的紫外照射，紫外照射條件：紫外燈30 W、垂直照射距離30 cm，照射時(shí)間分別為0，15，30，45，60，75，90，105，120 s。以照射時(shí)間為0 s的菌懸液為對(duì)照，按式(1)計(jì)算不同照射時(shí)間的致死率，并確定最佳誘變劑量[13]。

(1)

式中：

L——致死率，%；

n1——對(duì)照組活菌菌落形成單位，CFU/mL；

n2——處理組活菌菌落形成單位，CFU/mL。

1.2.3 DES誘變致死率曲線(xiàn)的測(cè)定 在250 mL的三角瓶中加入100 mL孢子懸液，取1 mL DES加至菌液中混勻，分別處理0，15，30，45，60，75，90，120 min后，取樣5 mL用2.5 mL 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)致死率并確定最佳的誘變劑量。

1.2.4 初篩

(1) 酪素雙層平板法：將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布于酪素雙層平板，待平板培養(yǎng)好后測(cè)定各菌落的K值(透明圈直徑與菌落直徑比)。

(2) 瓊脂塊法：將經(jīng)復(fù)合誘變后的孢子懸液涂布于PDA平板，上述平板用黑布包好于28℃培養(yǎng)48 h。挑選菌落直徑較大的菌株，打孔器打下，接種于酪素—瓊脂雙層平板，選取透明圈較大者作為進(jìn)一步篩選菌株。

1.2.5 復(fù)篩 取1 mL 106CFU/mL的初篩后菌株的孢子懸液于制曲培養(yǎng)基中，32℃恒溫培養(yǎng)36 h。采用Folin—酚法[14]測(cè)定蛋白酶酶活力。

1.2.6 醬油發(fā)酵試驗(yàn) 按0.3%的接種量將發(fā)酵菌株接種于制曲培養(yǎng)基中，攪拌混勻，32℃保溫發(fā)酵36 h，不定時(shí)翻曲。按成曲∶鹽水為 1∶1.2(g/mL)加入16%的鹽水，置于45℃保溫發(fā)酵12 d，再以成曲∶鹽水為1∶0.8(g/mL)添加20%的鹽水，35℃后發(fā)酵10 d，發(fā)酵期間每天循環(huán)淋澆一次，發(fā)酵結(jié)束后抽提頭油。氨基酸態(tài)氮和全氮測(cè)定：分別按甲醛法和凱氏定氮法執(zhí)行[15]。

(2)

式中：

U——全氮利用率，%；

M1——醬油頭油總質(zhì)量，kg；

C1——醬油頭油全氮含量，%；

M2——醬油二油及三油總質(zhì)量，kg；

C2——醬油二油及三油混合物全氮含量，%；

M3——豆粕質(zhì)量，kg；

C3——豆粕全氮含量，%；

M4——小麥質(zhì)量，kg；

C4——小麥全氮含量，%；

M5——麩皮質(zhì)量，kg；

C5——麩皮全氮含量，%。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將最終篩選所得的突變菌株進(jìn)行10次試管斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，然后制曲測(cè)其酶活，驗(yàn)證突變菌株的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 出發(fā)菌株的選擇及性能測(cè)定

從曲精樣品中分離得到CS3.03，測(cè)定其在PDA平板上的菌落直徑，瓊脂塊酪素-瓊脂平板上的透明圈直徑以及蛋白酶酶活力見(jiàn)表1。曲精酶活為1 254.98 U/g干基，CS3.03的蛋白酶活力比原曲精提高了45.28%，其具有較好的產(chǎn)蛋白酶基礎(chǔ)，且生長(zhǎng)良好，可以作為誘變育種出發(fā)菌株。

表1 出發(fā)菌株CS3.03性能測(cè)定Table 1 Performance measurement of the original strain CS3.03

2.2 復(fù)合誘變條件的確定

紫外(UV)誘變作為一種誘變頻率高，不易回復(fù)突變的物理誘變方法，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)微生物育種[16]。DES是單功能烷化劑，具有誘變劑量易控制，對(duì)基因組損傷小，誘變效果好的優(yōu)點(diǎn)。誘變中采用一種誘變劑處理時(shí)突變的位點(diǎn)比較單一，難以產(chǎn)生較好的突變效果。采用兩種以上誘變劑復(fù)合誘變，易產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增加突變位點(diǎn)，使突變效率變高，且使獲得正突變株的可能性增大。試驗(yàn)選取UV—DES復(fù)合誘變，經(jīng)測(cè)定，紫外照射時(shí)間為劑量的誘變致死率曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，1%DES對(duì)孢子懸液進(jìn)行誘變處理的致死率曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。根據(jù)誘變劑致死與誘變效果雙重效應(yīng)，過(guò)高的致死率篩選量較少但不利于正突變，因此低于80%的致死率處理將有利于獲得正突變菌株，且減少篩選量。由圖1、2可知，UV照射時(shí)間為30 s，致死率為40%，DES處理30 min 時(shí)，致死率為60%。因此，選擇UV對(duì)孢子懸液處理30 s后用DES處理30 min，其致死率在70%～80%，誘變效果較好且易篩選。復(fù)合誘變后平板初篩獲得200株生長(zhǎng)良好的突變株。

圖1 紫外誘變致死率曲線(xiàn)Figure 1 Lethality of UV light mutagenesis

圖2 DES誘變致死率曲線(xiàn)Figure 2 Lethality of DES treatment

2.3 高蛋白酶酶活突變株平板初篩

2.3.1 酪素平板法 米曲霉具有產(chǎn)水解蛋白酶能力，能夠分解酪素培養(yǎng)基中的酪蛋白，從而產(chǎn)生出透明圈。吳華昌等[17]研究表明，采用酪蛋白透明圈法可以初步估算曲霉蛋白酶的相對(duì)酶活性高低，從而大大減少?gòu)?fù)篩的工作量。從200株突變菌中選取15株進(jìn)行編號(hào)并制曲測(cè)定酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，酪素雙層平板初篩突變菌中，Y9號(hào)菌K值最大；而制曲復(fù)篩測(cè)定蛋白酶酶活的結(jié)果中，Y5號(hào)菌的酶活最大，達(dá)到4 972.89 U/g干基，相比于出發(fā)菌提高了172.8%。從圖3還可以看出，蛋白酶酶活與K值存在一定的關(guān)系，但K值大的蛋白酶酶活不一定高，如Y12的K值高于Y13，但蛋白酶酶活卻低于Y13，說(shuō)明K值在一定程度上可以反映蛋白酶酶活的高低，但是對(duì)于K值相近的菌株此法的準(zhǔn)確度較低。

圖3 15株突變株的K值與蛋白酶酶活對(duì)比Figure 3 Diameter ratio of clarity circle & colony and proteinase activity of 15 mutants

2.3.2 瓊脂塊法 由于米曲霉的生長(zhǎng)蔓延性好，其菌落形態(tài)不規(guī)則、邊緣不清晰，透明圈直徑較難測(cè)定，從而導(dǎo)致K值(透明圈直徑與菌落直徑比)的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較低；且各菌之間的K值很小，難以反應(yīng)各菌之間產(chǎn)酶能力的差距。為提高初篩選效率，本試驗(yàn)還選用了瓊脂塊法，將突變株涂布PDA平板培養(yǎng)，選擇15株單個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好且均勻的菌落用打孔器打下，置于酪素—瓊脂平板上，經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)后直接測(cè)定其透明圈直徑，同時(shí)對(duì)各突變菌進(jìn)行蛋白酶酶活測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，透明圈直徑和蛋白酶酶活最大的都是P7號(hào)菌，其酶活為5 020.98 U/g干基，比出發(fā)菌提高了175.39%，也高于采用酪素雙層平板法篩選出的Y5號(hào)菌。瓊脂塊法的初篩結(jié)果與制曲法的復(fù)篩結(jié)果一致性較好，究其原因，是由于打孔器打下的瓊脂塊的厚度及直徑一致，因此突變菌產(chǎn)蛋白酶的差異可以直接從透明圈上反映出來(lái)，所以利用該法可以較為迅速且準(zhǔn)確地篩選出高產(chǎn)菌。

圖4 15株突變株的透明圈直徑及蛋白酶酶活Figure 4 Diameter of clarity circle and proteinase activity of 15 mutants

2.4 高蛋白酶酶活突變株醬油發(fā)酵試驗(yàn)

從30株突變菌株中優(yōu)選出5株高酶活米曲霉與出發(fā)菌株CS3.03對(duì)比進(jìn)行醬油發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定其氨態(tài)氮含量、全氮利用率，結(jié)果見(jiàn)表2。篩選得到的5株突變菌的蛋白酶酶活以及發(fā)酵醬油的氨態(tài)氮含量和全氮利用率都高于出發(fā)菌株CS3.03，其中突變株P(guān)7和Y5對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的提升作用比較明顯。相比于出發(fā)菌株，P7、Y5發(fā)酵醬油的氨態(tài)氮含量分別提高14.56%，11.26%；全氮利用率分別提高3.83%，4.09%，說(shuō)明通過(guò)UV—DES誘變篩選得到的蛋白酶高產(chǎn)株蛋白質(zhì)的利用能力具有明顯增強(qiáng)，在醬油發(fā)酵中能夠有效地提高全氮利用率。

表2 CS3.03與突變株蛋白酶酶活及發(fā)酵醬油質(zhì)量對(duì)比Table 2 The comparison of proteinase activity and the quality of its fermented soy sauce between CS3.03 and the mutants

2.5 突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

醬油發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明Y5、P7具有提高出品率和產(chǎn)品質(zhì)量的作用，將兩株蛋白酶高產(chǎn)菌進(jìn)行傳代10次培養(yǎng)并測(cè)定其蛋白酶酶活，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，突變株P(guān)7平均酶活為4 994.18 U/g干基，說(shuō)明突變菌株保持了較好的產(chǎn)酶穩(wěn)定性，且蛋白酶酶活力高；Y5平均酶活為4 710.63 U/g干基，Y5傳代培養(yǎng)中酶活較于P7酶活波動(dòng)略大，由此看出，P7的遺傳穩(wěn)定性更佳。綜合考慮蛋白酶酶活以及遺傳穩(wěn)定性，P7明顯優(yōu)于出發(fā)菌株和Y5菌株，可應(yīng)用于醬油的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖5 Y5號(hào)菌和P7號(hào)菌的遺傳穩(wěn)定性Figure 5 Genetic stability of mutant Y5 and P7

3 結(jié)論

米曲霉是醬油發(fā)酵主要菌種，其蛋白酶酶活大小直接影響醬油產(chǎn)品質(zhì)量，醬油生產(chǎn)中米曲霉蛋白酶酶活的保持及提升為醬油生產(chǎn)用菌改造的永恒主題。本試驗(yàn)研究證明UV—DES的理化復(fù)合誘變是比較方便有效的育種方法，初篩中采用瓊脂塊法可以減少酪素雙層平板的工作量并提高其篩選準(zhǔn)確性。經(jīng)上述誘變及篩選方法獲得了突變株P(guān)7，其蛋白酶酶活達(dá)4 994.18 U/g干基，比曲精分離的出發(fā)菌株CS3.03提高了173.92%，其發(fā)酵醬油的氨態(tài)氮含量提高14.56%，全氮利用率提高3.83%。P7遺傳穩(wěn)定性良好，是一株良好的醬油生產(chǎn)用菌。

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Multiple mutation breeding ofAspergillusoryzaewith high protease activity in soy sauce fermentation

YE Jing1JIANGXue-wei1LUOXiao-ming1ZHOUShang-ting2

YANGZi-jiang2JIANGXiao-hong2LIYao-bo2

(1.CollegeofChemical&Bioengineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China; 2.ChangshaJiajiaFoodCo.,Ltd,Changsha,Hunan410600,China)

The original strain ofAspergillusoryzaeCS3.03 isolated from koji powder was treated with the composite mutagen UV-DES. The mutants were screened with the method of casein plate and agar block. According to re-screening results detecting with the method of Folin-phenol, and the better screening means was found. At the same time, the fermentation ability of high protease activity mutants were tested in the state of low-salt solid-state fermentation technology, and the genetic stability of the best was tested by repeated multiplying. The results showed that the screening efficiency of agar block method was significantly higher than casein plate method. Five mutants of high protease activity with production potential were obtained by re-screening. The result of soy sauce fermentation test proved that the content of ammonia nitrogen and the utilization ratio of total nitrogen were higher than those of the original strain. The ammonia nitrogen in soy sauce fermented by mutant P7 and Y5 increased 14.56% and 11.26% respectively, and the utilization ratio of total nitrogen increased 2.92% and 3.12% in the same situation. Genetic stability test showed that P7 had great industrial application value and genetic stability, and its average protease activity was 4 994.18 U/gdb, which was 173.92% higher than that of the original bacteria.

Aspergillusoryzae; protease activity; multiple mutation; plate screening; soy sauce fermentation

長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重大專(zhuān)項(xiàng)、重點(diǎn)項(xiàng)目 (編號(hào)：kq1601013，K1403029-11)；湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心開(kāi)放基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015GCZX07)

葉菁，女，長(zhǎng)沙理工大學(xué)在讀碩士研究生。

蔣雪薇(1972—)，女，長(zhǎng)沙理工大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。E-mail：jxw_72@sina.com

2016-12-24

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.002