陳夢微 鄧群仙 張金容 呂秀蘭 夏 惠 王 進(jìn)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

葡萄不同品種和組織中白藜蘆醇含量及其抗氧化活性分析

陳夢微 鄧群仙 張金容 呂秀蘭 夏 惠 王 進(jìn)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

以6個(gè)品種3種色系葡萄的果梗、果皮及部分品種的葡萄籽為材料，采用有機(jī)溶劑法提取不同品種葡萄的果梗、果皮和種籽中的白藜蘆醇，利用HPLC測定提取液中白藜蘆醇的含量，并分析了白藜蘆醇對DPPH自由基和羥自由基的清除能力。結(jié)果表明，葡萄不同品種和組織間白藜蘆醇含量差異顯著，整體表現(xiàn)為果梗>果皮>種籽，果皮紫黑色品種>紅色>黃綠色；金田0608和夏黑果梗白藜蘆醇含量較高(22.4～22.6 μg/g)，陽光玫瑰和白羅莎里奧果梗藜蘆醇含量很低(1.2～1.8 μg/g)。除葡萄籽白藜蘆醇含量與DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)外，其它組織白藜蘆醇含量與自由基清除率無顯著相關(guān)性。金田0608和夏黑果梗、果皮白藜蘆醇提取液清除DPPH自由基和羥自由基的能力較強(qiáng)。

葡萄；白藜蘆醇；抗氧化活性

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是1940年在毛葉藜蘆根部首次發(fā)現(xiàn)的，是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、桑樹、虎杖等21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中[1-2]。Res是植物受到外界刺激產(chǎn)生的次生代謝物[3]，被認(rèn)為是茋類物質(zhì)單體中最重要的生物活性物質(zhì)[4-5]。近年來的研究表明，Res具有一定的抗氧化和抗腫瘤活性[6]，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[7]、抗多種腸道病毒[8]、預(yù)防老年癡呆癥[9]，并具有免疫調(diào)節(jié)作用[10]。

葡萄和葡萄產(chǎn)品被認(rèn)為是人類食品中Res的最重要來源[11]。葡萄不同品種、不同組織中Res的含量及其抗氧化活性存在差異。陳雷等[12]用HPLC法測定葡萄不同部位中Res的含量，發(fā)現(xiàn)其含量差異較大，葡萄果穗軸和果皮中的含量較高；孟憲軍等[13]以野生山葡萄的皮、籽為原料, 通過有機(jī)溶劑的提取，測得皮、籽中Res含量為0.159，0.036 mg/g；李婷等[14]采用有機(jī)溶劑法提取材料中的Res，結(jié)果表明不同葡萄品種以及不同組織之間Res含量差異較大，并且果梗、葉片>果皮>種籽>葉柄；孫崇德等[15]研究發(fā)現(xiàn)，紅皮葡萄果實(shí)生物活性物質(zhì)水平和抗氧化活性均高于白皮葡萄；馮濤等[16]發(fā)現(xiàn)Res對DPPH·的清除率隨著其濃度的增大而提高；劉林麗等[17]研究也表明，在一定濃度范圍內(nèi)，Res的抗氧化能力隨著濃度的增加而加強(qiáng)。

避雨栽培現(xiàn)已成為中國南方夏季高溫多雨寡日照地區(qū)葡萄栽培的主要方式，對該模式下不同色澤葡萄品種果實(shí)的不同組織中白藜蘆醇合成積累及其抗氧化活性分析鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬以四川盆地避雨栽培下6個(gè)品種3種色系葡萄的果梗、果皮及有籽葡萄品種的葡萄籽為材料，采用有機(jī)溶劑法提取Res并測定其含量，綜合Res提取液對DPPH·和·OH的清除率來評價(jià)其抗氧化活性，旨在篩選出四川盆地鮮食葡萄中Res含量高與具有優(yōu)良抗氧化活性的品種，為葡萄資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材取自四川省彭山區(qū)觀音鎮(zhèn)果園村同一葡萄園內(nèi)的6個(gè)鮮食葡萄品種。其中，黃綠色系品種為3年生的陽光玫瑰(中熟、歐美雜交種、有籽品種進(jìn)行了無籽化處理)、3年生白羅莎里奧(晚熟、歐亞種，有籽)；紅色系：5年生克瑞森(晚熟、歐亞種、無籽)、7年生紅地球(中晚熟、歐亞種，有籽)；紫黑色系：5年生夏黑(早熟、歐美雜交種、無籽)、5年生金田0608(晚熟、歐亞種，有籽)。供試品種均采用“地膜+天膜”雙膜覆蓋避雨栽培。

1.2 采樣與處理

于果實(shí)成熟期分別從不同品種果穗的果頂、果肩、果中、果底均勻采樣，選擇著色好、果粒均勻、無裂果的果實(shí)200顆，每個(gè)處理3株，3次重復(fù)。采后立即用冰盒帶回試驗(yàn)室，于室內(nèi)分離果梗、果皮和葡萄籽。干樣制備參照文獻(xiàn)[18]并稍作修改：樣品放在恒溫烘箱內(nèi)(60℃)烘36 h，粉碎，過60目篩后分裝，用錫箔紙包裝放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)儀器與試劑

超聲波清洗器：KH5200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1800型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

電子天平：Sartoriu S A G型，北京賽多利斯公司；

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC級，美國Sigma公司；

甲醇：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

DPPH：分析純，美國Sigma公司；

其他試劑：國產(chǎn)分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 Res的提取與含量測定 參照文獻(xiàn)[19]采用有機(jī)溶劑法提取樣品中Res，HPLC法測定Res含量。

(1) 色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相中A液為水，B液為乙腈；梯度洗脫；洗脫方法為：起始時(shí)，A液為85%，B液為15%，5 min后，A液為76%，B液為24%，至33 min時(shí)，A液為60%，B液為40%；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為306 nm。

(2) Res標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取Res標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，準(zhǔn)確吸取該儲備液1 mL，稀釋成20 μg/mL對照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述對照品溶液，分別以5，10，15，20，25 μL的不同體積進(jìn)樣，標(biāo)記Res保留時(shí)間，測定其峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

(3) Res提取液的配制：準(zhǔn)確稱取6個(gè)葡萄品種粉碎過篩后的果梗、果皮、果籽粉末各1 g，置于具塞三角瓶中，加40%的乙醇，在60℃下水浴浸提60 min。取出經(jīng)過濾、減壓蒸餾后回收乙醇，濃縮后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，按1∶1加入乙酸乙酯液萃取3次，收集并合并上層有機(jī)相。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，回收乙酸乙酯，殘留物用甲醇溶解并定容至5 mL。將上述溶液用微孔濾膜(φ=0.45 μm)過濾，得樣品提取液。因Res對光敏感，提取過程中需避光。

1.4.2 Res抗氧化活性的測定

(1) DPPH自由基的清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[17]檢測Res提取液對DPPH·的清除能力。每個(gè)處理做3個(gè)平行樣，按式(1)計(jì)算其清除率。

(1)

式中：

C——清除率，%；

A0——1.0 mL無水乙醇加3.0 mL DPPH溶液的吸光度；

Ai——1.0 mL待測液加3.0 mL DPPH溶液的吸光度。

(2) 羥自由基(·OH)的清除能力：參照文獻(xiàn)[20]檢測Res提取液對·OH的清除能力。每個(gè)處理做3個(gè)平行樣，按式(2)計(jì)算其清除率。

(2)

式中：

C——清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

Ax——加入待測溶液后的吸光度；

Ax0——不加顯色劑H2O2的細(xì)胞破碎液本底吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010及SPSS 17.0 軟件處理，進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)以平均值±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Res標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

Res標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間10.6 min，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，Res標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=16 914x-69.601(r2=0.999 83)，Res在0.1～0.5 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 葡萄不同品種和組織中Res含量差異

葡萄不同品種和組織Res含量存在極顯著差異。由表1可知，供試6個(gè)品種中均表現(xiàn)出果梗中Res含量高于果皮和種籽，果梗Res含量高于果皮2.00～11.26倍。在有籽葡萄品種中，種籽的Res含量很低，僅為0.52～2.05 μg/g，是同一品種果梗Res含量的6.4%～7.2%。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 1 Chromatogram of resveratrol standard

圖2 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The standard curve of resveratrol

不同品種同一組織中Res含量差異顯著。果皮紫黑色的金田0608和夏黑及紅色的克瑞森果梗中Res含量都較高，比黃綠色的白羅莎里奧和陽光玫瑰高了11.32～18.48倍。

果皮Res含量以夏黑最高，金田0608次之，白羅莎里奧最低，僅為夏黑果皮的10.7%、金田0608果皮的15.9%?？傮w呈現(xiàn)紫黑色品種果皮Res含量>紅色品種>黃綠色品種的規(guī)律，表明葡萄果皮著色越深，其Res含量越高。

葡萄品種不同以及組織部位不同，使得葡萄中Res含量存在差異，其生物活性也不同。Okuda等[21]對葡萄果皮Res含量的分析表明，不同品種果皮中含量差異較大，其含量為0.5～14.1 μg/g。孫崇德等[15]檢測的5個(gè)品種葡萄果皮Res含量為0.57～6.31 μg/g。本試驗(yàn)進(jìn)一步證明了不同品種中Res含量差異較大，供試6個(gè)品種果梗、果皮、種籽Res含量分別為1.22～22.55，0.61～5.68，0.52～2.05 μg/g。

本試驗(yàn)中，葡萄果梗和果皮Res含量總體呈現(xiàn)紫黑色品種>紅色品種>黃綠色品種的規(guī)律，表明葡萄果皮著色越深，其Res含量越高，這與前人研究結(jié)果一致。孫崇德等[15]檢驗(yàn)的5個(gè)葡萄品種中，果皮顏色最深的玫瑰紅，其果皮Res含量為6.31 μg/g，顯著高于其它4個(gè)品種。Okuda等[21]研究結(jié)果表明，紅葡萄酒Res的平均含量是白葡萄酒的6倍。同一色系不同品種葡萄皮中Res含量表現(xiàn)出晚熟品種低于早熟、中熟或中晚熟品種，可能是Res在果實(shí)成熟期合成能力下降，并且較長的生長周期使Res降解所導(dǎo)致的。李阿英等[22]的研究表明葡萄皮Res的含量隨著葡萄的成熟和著色而降低，并且在著色深的葡萄皮中下降快。在有籽葡萄中，晚熟黃綠色品種白羅莎里奧葡萄籽Res含量顯著高于金田0608和紅地球，表明葡萄籽中Res含量可能不受果實(shí)成熟和著色的影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，同一葡萄品種不同組織中Res含量的分布規(guī)律為：果梗>果皮>種籽，這與李婷等[14]研究表明葡萄果梗、葉片>果皮>種籽>葉柄的結(jié)果一致。孟憲軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)野生山葡萄果皮中Res含量為0.159 mg/g，而種籽中含量僅為0.036 mg/g。而陳雷等[12]的研究結(jié)果表明葡萄果穗軸Res含量高于果皮和種籽，三者中種籽含量最低；李阿英等[22]研究發(fā)現(xiàn)葡萄果皮中Res的含量最高，其次是種籽，果梗中的含量最低。這些研究結(jié)果的差異可能由試驗(yàn)原料的種類、品種、生態(tài)環(huán)境以及果實(shí)發(fā)育時(shí)期不同所導(dǎo)致的。李阿英等[22]還發(fā)現(xiàn)，在葡萄整個(gè)生長發(fā)育過程中，果皮和種籽中Res含量均呈先增加后下降的趨勢。所以，即使是同一品種的葡萄，不同的測定時(shí)期，各組織中Res含量也可能存在差異。

表1 葡萄不同品種和組織中白藜蘆醇的含量?Table 1 Contents of resveratrol in different varieties and tissues of grapes μg/g

2.3 葡萄不同品種和組織中Res提取液對自由基的清除能力比較

2.3.1 果梗Res提取液對DPPH·和·OH的清除能力

由表2可知，6個(gè)品種果梗Res提取液對DPPH·的清除率均在86%以上，明顯高于對·OH的清除率(41%～51%)。供試3種果皮色澤6個(gè)品種間，果梗Res提取液對DPPH·和·OH兩種自由基的清除能力存在一定的差異；果梗Res提取液清除·OH能力總體表現(xiàn)出紫黑色>紅色>黃綠色品種；陽光玫瑰果梗Res提取液對DPPH·的清除能力最大，是其它品種的1.02～1.03倍；但對·OH的清除率最小，為其它品種的80.2%～94.1%。

2.3.2 果皮Res提取液對DPPH·和·OH的清除能力

由表3可知，果皮Res提取液對DPPH·和·OH清除能力各品種間差異顯著。金田0608果皮Res提取液清除DPPH·和·OH能力最高，均極顯著高于其它品種，分別為其它品種的1.14～3.20倍和1.31～1.52倍，其次分別是夏黑和陽光玫瑰，白羅莎里奧果皮Res提取液清除DPPH·能力最低，僅為27.48%。同時(shí)，同一品種果皮Res提取液對DPPH·清除率總體上低于果梗，而對·OH清除率均高于果梗。

表2 葡萄不同品種果梗白藜蘆醇提取液對自由基的清除能力?Table 2 The cleaning radicals activity of resveratrol in fruit stem of different varieties of grapes %

表3 葡萄不同品種果皮白藜蘆醇提取液對自由基的清除能力?Table 3 The cleaning radicals activity of resveratrol in fruit skin of different varieties of grapes %

2.3.3 葡萄籽Res提取液對DPPH·和·OH的清除能力

對于有籽葡萄品種，與果梗Res提取液清除自由基能力規(guī)律相同，葡萄籽Res提取液對DPPH·的清除率均明顯高于對·OH的清除率，品種間對DPPH·和·OH兩種自由基清除能力差異不大，分別為86.82%～88.15%，25.73%～45.78%(表4)。供試3種果皮色澤的3個(gè)品種中，葡萄籽Res提取液清除·OH能力總體表現(xiàn)出紫黑色<紅色<黃綠色品種，呈現(xiàn)出與果梗相反的規(guī)律；白羅莎里奧對DPPH·和·OH清除率均最高。

2.4 葡萄組織Res含量與清除DPPH·和·OH能力的相關(guān)性分析

由表5可知，DPPH·清除率與葡萄果梗白藜蘆醇含量表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，與果皮和葡萄籽Res含量表現(xiàn)出正相關(guān)；羥自由基清除率與葡萄果梗、果皮、葡萄籽白藜蘆醇含量同樣表現(xiàn)出正相關(guān)，但僅有葡萄籽Res含量與清除DPPH·能力間的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

表4 葡萄不同品種葡萄籽白藜蘆醇提取液對自由基的清除能力?Table 4 The cleaning radicals activity of resveratrol in grape pip of different varieties of grapes %

表5 葡萄不同組織白藜蘆醇含量與清除自由基能力的相關(guān)性分析?Table 5 Correlation analysis between contents and the cleaning radicals activity of resveratrol in different tissue of grapes

葡萄不同品種和組織中Res的抗氧化活性不同。前人研究結(jié)果表明，Res具有較高的抗氧化活性。劉林麗等[17]發(fā)現(xiàn)較低濃度的Res對DPPH·就有較高的清除率，馮濤等[16]發(fā)現(xiàn)葡萄籽Res對DPPH·的清除率隨著濃度的增加而提高，本試驗(yàn)中除了葡萄籽Res含量與其對DPPH·清除率存在顯著正相關(guān)性外，果梗和果皮中Res含量與其對應(yīng)的自由基清除能力均無顯著相關(guān)性。葡萄組織中尤其是黃綠色葡萄品種常含有脂溶性類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素和葉黃質(zhì)，這些物質(zhì)同樣具有較強(qiáng)的清除自由基能力[23]。本試驗(yàn)在采用HPLC法測定Res含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)色譜圖中除了Res標(biāo)準(zhǔn)峰外，還出現(xiàn)了多個(gè)大小不一的峰，推測供試葡萄品種不同組織乙醇提取液中除了含有Res外，還含有同為脂溶性的類胡蘿卜素。因此，盡管黃綠色品種陽光玫瑰、白羅莎里奧果梗、果皮及種籽(白羅莎里奧)以及其他品種的果皮、種籽中Res含量不高，但其乙醇提取液卻具有較高的DPPH·和·OH清除率，可能與其組織中除含有Res活性物質(zhì)外還含有豐富的類胡蘿卜素有關(guān)。此外，也有研究[20]表明，葡萄籽總酚含量、總黃酮含量、總黃烷醇含量與其DPPH·清除率無顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以3種色系6個(gè)品種葡萄為材料，利用HPLC測定了不同葡萄品種的不同組織中白藜蘆醇含量，并分析了白藜蘆醇對DPPH·和·OH的清除能力。研究得出葡萄果梗白藜蘆醇含量最高，其次分別為果皮、種籽；紫黑色品種果皮白藜蘆醇含量高于紅色品種和黃綠色品種；金田0608和夏黑果梗、果皮白藜蘆醇提取液清除DPPH·和·OH的能力較強(qiáng)；除葡萄籽外，其它組織白藜蘆醇含量與自由基清除率無顯著相關(guān)性。

葡萄不同品種和組織Res含量的不同，為葡萄果實(shí)的鮮食和深加工利用提供了理論依據(jù)。葡萄采收后舍棄的部位，如Res含量較高的果梗和果皮，可用作提取材料，從而充分利用資源，并且能提高提取效率。葡萄不同品種及組織中生理活性物質(zhì)及其抗氧化活性，除研究報(bào)道最多的Res外，類胡蘿卜素的組分、含量及其抗氧化分析有待進(jìn)一步研究。

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The analysis of resveratrol contents and their antioxidant activity in different varieties and tissues of grapes

CHEN Meng-weiDENGQun-xianZHANGJin-rongLUXiu-lanXIAHuiWANGJin

(CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

The stems, skin and some varieties of grape seeds from six varieties classified as three kinds of color grape were used to extracted the resveratrol by organic solvent and then detected its content by HPLC. Moreover, the effect of resveratrol on DPPH radical and hydroxyl radical scavenging ability were also studied. The results showed that the resveratrol content in different grape varieties and tissue distributed differently, and the volume decreased in fruit stem, skin, and pip orderly. Furthermore, it was also found that the resveratrol content in the varieties of purple-black was the highest in the fruit skin, but it was the lowest in the varieties of yellow-green. The resveratrol content in stem of ‘Jintian 0608’ and ‘Summer Black’ was higher (22.4～22.6 μg/g), but it was very low (1.2～1.8 μg/g), in those of ‘Sunshine Rose’ and ‘White Rosario’ stems. It was confirmed that the resveratrol content in grape pip was significantly positively related to DPPH free radical clearance, however no significant correlation was found between the content of other tissues and this clearance. Finally, the resveratrol extracts from the fruit stem and skin of ‘Jintian 0608’ and ‘Summer Black’ were found showing stronger ability in cleaning both DPPH and hydroxyl radicals than those of the other tissues.

grape; resveratrol; antioxidant activity

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(編號：2012JY0046)；四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目；四川省教育廳科技成果轉(zhuǎn)化重大培育項(xiàng)目

陳夢微，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

鄧群仙(1968—)，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail：1324856299@qq.com

2016-11-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.034