王順民 汪建飛

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

超聲波處理對苦蕎麥萌發(fā)、芽苗還原糖和總黃酮含量及抗氧化活性的影響

王順民 汪建飛

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

采用超聲波預處理苦蕎麥種子，研究超聲波的功率、時間和溫度對苦蕎麥種子萌發(fā)率及麥苗還原糖、總黃酮含量和對DPPH自由基清除能力的影響。結果表明：超聲波的功率、時間和溫度對種子的初始萌發(fā)率影響顯著。在超聲波功率280 W、溫度20℃、時間35 min處理條件下，苦蕎麥種子的初始萌發(fā)率和最終萌發(fā)率分別達88.00%和100%。在超聲波功率240 W、溫度 15℃、時間35 min處理條件下，苦蕎麥芽苗(4 d)中還原糖含量最高達11.24 g/100 g，分別比種子和對照增加303.99%和40.03%。而在超聲波功率280 W、溫度30℃、時間30 min處理條件下，苦蕎麥芽苗(6 d)中總黃酮的含量達9.46 g/100 g，分別比種子和對照增加228.07%和69.71%，該條件下芽苗對DPPH自由基的清除率達86.47%。

苦蕎麥；萌發(fā)；還原糖；總黃酮；DPPH

苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)是一種藥食兩用植物，富含黃酮類化合物[1]?？嗍w麥萌發(fā)后蘆丁含量成倍增加，營養(yǎng)價值和生物活性顯著提高[2-5]。一些研究表明，磁場[6]、電場和超聲波[7]等物理因素會對植物組織表現(xiàn)出一定的誘導效應[8-9]，從而對萌發(fā)胚芽生長有調控作用[10-11]，能有效激活蕎麥種子萌發(fā)期的苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)和查爾酮異構酶 (chalconeisomerase，CHI)，使黃酮類物質合成量增加[6]。植物在逆境脅迫下，通過調節(jié)基因的表達，細胞產生快速感應，進而使相關酶的活性發(fā)生變化，同時，黃酮類化合物和脯氨酸(Pro)等滲透調節(jié)物質含量增加，以此適應脅迫環(huán)境。超聲波等逆境脅迫可誘導PAL和CHI基因的表達[12]。李妹娟等[13]研究表明，超聲波處理可使在鹽脅迫下水稻種子的萌發(fā)率均高于對照處理，使a-淀粉酶活性顯著提高，MDA含量降低，SOD和POD活性增強。超聲波(240 W，30 min，35℃)結合添加苯丙氨酸處理，可使發(fā)芽花生中白藜蘆醇的含量比種子增加9.4倍[14]。超聲波處理不僅可改善萌發(fā)后黃豆芽的品質[15]，增加營養(yǎng)性，而且能有效增加發(fā)芽谷物中次生代謝產物的含量，增加其營養(yǎng)價值，提高發(fā)芽谷物品質[16]。目前采用超聲波提取黃酮類物質報道較多[17-19]，而關于超聲波預處理植物種子后萌發(fā)富集活性成分的報道很少，僅報道[20]了超聲波處理時間對甜蕎的萌發(fā)及成分含量的影響。本研究將系統(tǒng)地研究超聲波功率、處理時間，溫度與苦蕎種子的萌發(fā)及芽苗生物活性成分富集的關系。本試驗擬采用超聲波處理苦蕎麥種子，研究超聲波處理對萌發(fā)后的苦蕎麥芽苗中還原糖、黃酮類物質的含量以及抗氧化性的影響。以期為促進苦蕎麥種子萌發(fā)和提高其芽苗菜營養(yǎng)價值提供一種新的方法，為超聲波技術的工業(yè)化應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

苦蕎麥：寧夏鹽池縣種子公司；

蘆丁、3，5-二硝基水楊酸、1，1-二苯-2-苦基肼等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：PYX-DHS·350-BS型，上海博泰實驗設備有限公司；

電子天平：JY1002型，上海良平儀器儀表有限公司；

超聲波清洗機：JK-400CDB型，合肥金尼克機械制造有限公司；

冷凍離心機：TGL-16A型，長沙平凡儀器儀表有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-5800PC型，上海元析儀器有限公司；

大容量離心機：L-550型，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 選擇粒大、飽滿的苦蕎麥種子，用清水沖洗干凈，以1.0 g/L高錳酸鉀溶液[7]浸泡消毒5～10 min，用清水洗滌至澄清。轉入25℃純凈水中浸泡4 h，期間換水一次。后將種子置于50～60℃溫水中催芽15 min。將種子(每組50～60粒)置于100 mL燒杯中，加入純水浸沒，進行超聲波處理。

1.2.2 超聲波處理對苦蕎麥種子萌發(fā)的影響

(1) 超聲波功率對種子萌發(fā)的影響：預處理后的苦蕎麥種子置于燒杯，分別在功率為200，240，280，320，360，400 W，溫度為20℃下，超聲波處理30 min。后測定種子的萌發(fā)率，芽苗中總黃酮、還原糖含量及對DPPH自由基的清除能力。

(2) 超聲波時間對種子萌發(fā)的影響：預處理后的苦蕎麥種子置于燒杯，在功率為280 W，溫度為20℃下，分別超聲波處理10，15，20，25，30，35 min。后測定種子的萌發(fā)率，芽苗中總黃酮、還原糖含量及對DPPH自由基的清除能力。

(3) 超聲波溫度對種子萌發(fā)的影響：預處理后的種子置于燒杯，在功率為280 W，溫度分別為15，20，25，30，35，40℃，超聲波處理35 min。后測定種子的萌發(fā)率，芽苗中總黃酮、還原糖含量及對DPPH自由基的清除能力。

以上3種處理均做對照試驗(除超聲波未工作以外，其它條件相同下進行試驗)。

1.2.3 苦蕎麥種子萌發(fā)試驗 將經超聲波處理后的苦蕎麥種子瀝水，均勻平鋪在內襯雙層濾紙直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，后移至種子培養(yǎng)箱中，于25℃，RH 70%～80%下進行避光培養(yǎng)1～9 d，每天補充散失的水分2～4 mL。每12 h統(tǒng)計發(fā)芽種子數[8]。取生長期為2，4，6 d長勢相同的苦蕎麥芽苗稱重，研磨，作為待測樣品，進行各指標測定。

1.3 試驗指標及測定方法

1.3.1 萌發(fā)率 自開始培養(yǎng)起，每隔12 h，依次測量其萌發(fā)率(胚軸突破種皮1 mm即為萌發(fā))，連續(xù)測定7 d，每組重復3次，直至個別處理組萌發(fā)率達到100%。萌發(fā)率及最終萌發(fā)率分別按式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：

Gt——萌發(fā)率，%；

Gf——最終萌發(fā)率，%；

m1——種子在1 d內的全部正常發(fā)芽粒數，粒；

梨花松開方竹沿河而行，她知道從此一別，就是永生。梨花走在河北岸，方竹走在河南岸；倆人依舊默默地隔河而行，邊走邊你看我一眼、我看你一眼。不知不覺，又回到他們相遇的地方，彼此都站住了。良久，梨花讓方竹先走；但方竹不走，他讓梨花先走。方竹說：“回去吧！回去……”梨花依舊沒動。方竹又揮手道：“回去吧！回去……”梨花這才毅然轉過身去，眼淚就嘩地涌了出來。她小跑了幾步，突然又站住了，轉過身來，只見方竹依舊站在河邊，呆呆地望著她，她就轉身跑了。

m2——種子在7 d內的全部正常發(fā)芽粒數，粒；

m——供測種子的總粒數，粒。

1.3.2 總黃酮 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法[21]。將一定量的蕎麥芽置于研缽中，加少量石英砂，以60%的乙醇進行研磨、提取，提取液用冷凍離心機在9 000 r/min下離心15 min，取上清液進行總黃酮測定。

1.3.3 干物質和還原糖含量

(1) 干物質含量：采用烘干恒重法[22]。

(2) 還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法[23]。

1.3.4 DPPH自由基清除能力 取苦蕎麥芽苗乙醇提取物(60%乙醇，定容至50 mL) 液0.2 mL，加入7.8 mL濃度為0.025 mg/mL DPPH乙醇溶液，立即混勻，在一定時間間隔內(10 min) 測定其在517 nm處的吸光度。以VC做陽性對照。按式(3)計算苦蕎麥芽苗對DPPH自由基的清除率[21]。

(3)

式中：

Q——對DPPH自由基的清除率，%；

A0——0時刻DPPH自由基反應液的吸光度；

At——t時刻DPPH自由基反應液基本穩(wěn)定時的吸光度。

1.4 試驗數據統(tǒng)計與方法

試驗數據為3次重復，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對其進行One-way方差分析(ANOVA)；并用Duncan's復相關試驗法進行均值差異性的相關分析，顯著性水平P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理對萌發(fā)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響

苦蕎麥種子吸水膨脹后，在24 h 時開始發(fā)芽，但在超聲波的影響下部分種子發(fā)芽遲緩，甚至不發(fā)芽；而84 h時，不同超聲波處理種子的萌發(fā)率達90%以上。之后繼續(xù)培養(yǎng)，各處理種子的萌發(fā)率接近100%。故選擇24，84 h的發(fā)芽率評價超聲波處理對苦蕎麥種子發(fā)芽率的影響。由表1可知，培養(yǎng)24 h時，苦蕎麥種子的萌發(fā)率，隨超聲波功率的增加先增加后降低，隨超聲波處理時間的增加而升高(P<0.05)，隨超聲波處理溫度的升高而降低(P<0.05)，且分別在功率為240 W、時間為 35 min和溫度為20℃時萌發(fā)率最高。而培養(yǎng)84 h，萌發(fā)率差異不顯著。說明低功率下促進萌發(fā)，而高功率則抑制萌發(fā)。在低功率下，延長超聲時間和升高溫度均有助于種子萌發(fā)。但溫度過高則會抑制其萌發(fā)。因為超聲波處理溫度升高，會導致種子中酶的活性降低[24]，抑制生長。不同超聲波功率、時間和溫度對種子初始萌發(fā)速率有影響，可能是少量的超聲波能刺激細胞分裂，中等量的超聲波會抑制細胞分裂，大量的能引起細胞死亡，長時間、大劑量的超聲波處理則會造成負面的不可逆的影響[20]。有研究[20]證實，經10～20 min超聲波處理(480 W)的蕎麥種子萌發(fā)率比未經處理的增加90%，而超過30 min處理的萌發(fā)率反而降低。超聲波處理可提高活力、顯著促進蕎麥萌發(fā)及幼苗的生長。但時間過久則會導致種子中酶活性降低。Yaldagard等[21]證實，在功率460 W，溫度30℃下，超聲波處理時間由5 min 延長至15 min時，可使大麥芽中а-淀粉酶的活性降低67.63%。超聲波作為一種非生物逆境脅迫，對植物會造成一定的損傷。即適宜超聲波功率、時間和溫度均影響種子的萌發(fā)速率，但不會使種子失去萌發(fā)能力。

表1 不同超聲波處理對苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響?Table 1 Effects of ultrasound treatment on the germination rate of seeds

2.2 超聲波處理對苦蕎麥芽苗中還原糖含量的影響

由圖1可知，超聲波處理后的苦蕎麥芽苗的還原糖含量隨著超聲波功率的增加先增加后降低。培養(yǎng)2 d時，不同功率處理下的芽苗中還原糖含量顯著高于種子而低于對照，而培養(yǎng)4～6 d 時，則顯著高于種子和對照。培養(yǎng)6 d時，功率240 W下芽苗中還原糖含量比種子和對照組分別增加了3.36和0.21倍。說明超聲波功率對芽苗中還原糖含量的影響顯著(P<0.05)。

由圖2可知，培養(yǎng)2 d時，不同處理時間下，苦蕎麥芽苗中還原糖含量顯著高于種子。其中10～15 min處理下的芽苗中還原糖含量高于對照，而30～35 min處理低于對照。培養(yǎng)4～6 d時，不同時間處理下的苦蕎麥芽苗中還原糖含量顯著高于種子和對照，且隨超聲波處理時間的增加先升高后降低，其中培養(yǎng)4 d時，超聲10 min處理的種子，苦蕎麥芽苗中還原糖含量達11.07 g/100 g。但6 d時，苦蕎麥芽苗中還原糖含量要低于培養(yǎng)4 d的。萌發(fā)初期，種子中淀粉酶活力的逐漸增強，淀粉不斷水解，還原糖含量增加。由于超聲波處理加速了相關酶的活性，促進了芽苗生長，加速對還原糖的消耗，另外由于避光條件下無光合作用且呼吸作用會消耗還原糖等物質。

由圖3可知，隨著超聲波處理溫度的增加，培養(yǎng)2～4 d時，苦蕎麥芽苗還原糖的含量先升高后降低。培養(yǎng)4 d時，15℃處理的種子，苦蕎麥芽苗中還原糖含量最高，達11.24 g/100 g，比種子和對照分別增加303.99%和40.03%。作為一種非生物逆境脅迫，超聲波對植物會造成一定的損傷。在逆境脅迫下，植物通過調節(jié)基因的表達，細胞產生快速感應，進而使相關酶的活性發(fā)生變化，同時，并增加黃酮類化合物和脯氨酸(Pro)等滲透調節(jié)物質含量，以此適應脅迫環(huán)境。培養(yǎng)6 d時，除15℃處理外，不同溫度處理的還原糖含量均高于培養(yǎng)4 d的。因為適當的處理溫度能夠激活種子的淀粉酶，促進還原糖含量的增加。說明超聲波處理有利于糖代謝進行，對苦蕎麥種子萌發(fā)具有積極作用，但其處理溫度不能過高，此結果與表1的結果相一致。

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

2.3 超聲波處理對苦蕎麥芽苗中總黃酮含量的影響

由圖4可知，培養(yǎng)2 d時，苦蕎麥芽苗中的總黃酮含量顯著低于種子而略高于對照，且隨著功率的增加先增加后降低，功率小于360 W時，差異不顯著。培養(yǎng)4～6 d時，總黃酮含量顯著高于種子和對照(P<0.05)，且隨超聲波功率的增加先升高后降低，功率280 W處理的芽苗中總黃酮含量最高。當培養(yǎng)6 d時，功率280 W處理的芽苗中，總黃酮含量達8.75 g/100 g，比種子和對照組分別增加了2.03和0.57倍。超聲波功率對芽苗中總黃酮含量有顯著影響(P<0.05)。

由圖5可知，超聲波處理后，培養(yǎng)2 d 時的芽苗中總黃酮含量均顯著低于種子，但20～35 min處理下的含量高于對照。培養(yǎng)4 d時，總黃酮含量隨超聲波處理時間的增加而升高。30 min處理下，芽苗中總黃酮含量達4.77 g/100 g，比種子和對照分別增加65.36%和57.23%。培養(yǎng)6 d時，25，30 min 超聲處理下芽苗中總黃酮含量可達9.16 g/100 g，其比種子和對照分別增加2.18和0.64倍。超聲波處理時間的延長，顯著增加苦蕎麥芽苗中總黃酮含量。超聲處理有助于芽苗中總黃酮含量的增加，但時間超過30 min 后，總黃酮含量開始有所降低。

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

由圖6可知，培養(yǎng)2 d 時，隨著超聲波處理溫度的升高，苦蕎麥芽苗中總黃酮含量先增加后降低，30℃后含量高于對照。培養(yǎng)4 d時，芽苗中總黃酮含量在超聲波處理溫度低于15℃時低于種子和對照，而超聲波處理溫度為20～40℃時顯著高于種子和對照。培養(yǎng)6 d下，苦蕎麥芽苗中總黃酮含量隨著超聲波處理溫度的升高先升高后降低，30℃最高，其苦蕎麥芽苗中總黃酮的含量達9.46 g/100 g，分別比種子和對照增加228.07%和69.71%。培養(yǎng)6 d的芽苗中總黃酮含量的變化趨勢與生長4 d的相似，但在相同處理溫度下，含量要高于4 d處理?？赡芤驗榉N子為了適應這種形成的超聲波高溫脅迫環(huán)境，通過調節(jié)基因的表達，細胞快速感應，進而改變相關酶的活性后合成了較高量的黃酮類化合物以調節(jié)滲透物適應新的脅迫環(huán)境。

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

2.4 超聲波處理對苦蕎麥芽苗清除DPPH自由基能力的影響

由圖7可知，培養(yǎng)2 d，苦蕎麥芽苗對DPPH自由基的清除率隨超聲波處理功率的增加先升高后降低，功率240～280 W 處理的芽苗，其對DPPH自由基清除率顯著高于對照。培養(yǎng)4～6 d，240～280 W的功率處理下，超聲波處理后的芽苗對DPPH自由基的清除率顯著高于對照。其中培養(yǎng)6 d時，280 W功率的超聲波處理下，苦蕎麥芽苗對DPPH自由基的清除率為最高(85.64%)，比對照增加13.70%，高于VC對DPPH自由基的清除率。

由圖8可知，芽苗培養(yǎng)2 d 時，其對DPPH自由基的清除率隨超聲波處理時間的延長先升高后降低，15～35 min的超聲處理下芽苗對DPPH自由基的清除率高于對照，而10 min 處理低于對照。培養(yǎng)4 d時，超聲處理15～35 min下，苦蕎麥芽苗對DPPH自由基的清除率比對照增加了2.32%～6.86%。培養(yǎng)6 d時，不同超聲處理下的芽苗對DPPH自由基的清除率均顯著高于對照。其中30 min超聲處理的芽苗，其對DPPH自由基的清除率最高(83.81%)，比對照增加10.57%，與 VC相比差異不顯著。

由圖9可知，芽苗培養(yǎng)2 d時，芽苗對DPPH自由基的清除率隨超聲波處理溫度的升高先升高后降低。30℃ 處理下，芽苗對DPPH自由基的清除率最高，比對照增加8.72%。培養(yǎng)4 d時，15～40℃的超聲處理下，芽苗對DPPH自由基的清除率比對照增加了5.66%～11.66%。培養(yǎng)6 d時，不同超聲溫度下的芽苗對DPPH自由基的清除率比對照增加了4.71%～14.13%，其中溫度為30℃的超聲波處理下，芽苗對DPPH自由基的清除能力最高(清除率達86.47%)，高于 VC對DPPH自由基的清除率。本研究中，超聲處理(280 W，30 min，30℃)可使苦蕎麥芽苗中總黃酮的含量分別比種子和對照增加228.07%和69.71%，芽苗對DPPH的清除率為86.47%。蕎麥經超聲波處理(480 W，20 min)，蕎麥中總酚含量達到180.8 μg GAE/mL，總黃酮含量為156.701 mg蘆丁/g樣品，DPPH自由基清除活力達到最大值(0.197 mg Trolox eq/g凍干樣)[20]。超聲波預處理能有效提高苦蕎麥種子的萌發(fā)率，增加總黃酮含量，增強對DPPH自由基的清除能力，以適應不良環(huán)境。但是超聲波處理時，其功率、時間和溫度均對種子有交互影響，故超聲波處理的最佳工藝條件需要進一步優(yōu)化。

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

小寫字母表示每列中不同處理功率間顯著性差異(P<0.05)

3 結論

苦蕎麥種子經適宜的超聲波處理后，其萌發(fā)率顯著提高。苦蕎麥種子經超聲波處理后，超聲波的功率、時間和溫度對其萌發(fā)生長過程有著顯著影響，超聲波顯著增加蕎麥芽苗中還原糖、總黃酮的含量，并且增強其對DPPH自由基的清除能力。適宜功率的長時間超聲波處理，可以使苦蕎麥芽苗中總黃酮含量高于對照和種子。在不同超聲波功率、時間和溫度處理下，培養(yǎng)2，4，6 d的苦蕎麥芽苗中，總黃酮含量的高低與DPPH自由基清除能力大小的變化趨勢一致。即苦蕎麥芽苗中總黃酮的含量與DPPH自由基清除能力有一定的相關性。超聲波處理對種子中生物活性成分的富集機理有待更深入的探究。

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Ultrasonic enhancement of Tartary buckwheat germination and the production of nutrients in sprouts

WANG Shun-minWANGJian-fei

(CollegeofBiologicalandChemicalEngineering,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu,Anhui241000,China)

Tartary buckwheat (Fagopyrumtataricum) seeds were treated using ultrasonic at different power and time and temperature. The exposed grains were germinated, then harvested after incubation on the 2rd, 4th, and 6th days. The effects of ultrasonic on the germination rate of the tartary buckwheat seeds and some nutrient compounds in the sprouts were detected, and the DPPH radical-scavenging activities of the seedlings were investigated. The results showed that with treatment of 280 W ultrasonic, at 20℃ for 35 min, the highest rates of initial (88.0%) and final (100.0%) germination were obtained after incubation. With the treatment of 240 W ultrasonic, at 15℃ for 35 min, the seedlings produced the highest contents of the reduced sugar (11.24 g/100 g) after 4 day of incubation, and this was 303.99% and 40.03% more than those in the seeds and the control, respectively. A treatment of seedlings of 280 W, at 30℃ for 30 min got the highest the total flavones contents, i.e., 9.46 g/100 g after 6 day of incubation, which was significantly increased by 228.07% and 69.71% compared to those in the seeds and the control, respectively. Moreover, the DPPH radical-scavenging activities of the seedlings was found to be 86.47%.

buckwheat; germination; flavonoids; reduced the sugar; DPPH - radical scavenging capacity

安徽省教育廳高校自然科學研究重點項目(編號：KJ2016A061)；安徽工程大學國家科學基金預研項目(編號：2016yyzr08)；安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：20161036300221)

王順民(1975—)，男，安徽工程大學副教授，博士。 E-mail:wangshunmin@126.com

2016-11-29

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.037