馬超　馮文華　韓維田

[摘要]目的 比較FP、FP-V1和FP-V2在完全流產(chǎn)患者與不完全流產(chǎn)患者早孕蛻膜中mRNA的表達差異。方法 選取2013年6月～2015年3月遼寧省計劃生育科研院門診主動要求藥物流產(chǎn)終止正常妊娠的50例患者作為研究對象，根據(jù)流產(chǎn)是否完全分為完全組（30例）和不完全組（20例）。采用實時定量PCR方法檢測兩組早孕蛻膜中FP、FP-V1和FP-V2的表達差異。結(jié)果 不完全組早孕蛻膜中的FP和FP-V2的mRNA表達顯著高于完全組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩組的FP-V1表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 人早孕蛻膜FP-V2 mRNA高表達可能與不完全流產(chǎn)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]FP-V2亞型；藥物流產(chǎn)；蛻膜；不完全流產(chǎn)；早孕

[中圖分類號] R719.3+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（a）-0009-04

米非司酮配伍米索前列醇終止早孕最早應用于1988年并且已經(jīng)在31個國家廣泛開展[1]。在中國，米非司酮配伍米索前列醇的完全流產(chǎn)率可以達到93%左右[2]，但是仍有部分婦女遭受流產(chǎn)不全帶來的困擾，存在著流血時間長、生殖系統(tǒng)感染和貧血等一系列問題[3]。米非司酮是一種合成類醇，具有抗孕酮、糖皮質(zhì)激素和輕度抗雄激素特性，其靶結(jié)合位點是孕激素受體PR[4]。較早的研究認為，米非司酮抗早孕的機制是絨毛膜和蛻膜組織細胞失去孕激素的支持，使得蛻膜組織和絨毛滋養(yǎng)細胞發(fā)生變性、壞死，最終導致胚胎死亡而終止妊娠[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮可以使蛻膜組織中孕激素受體（PR）表達下降[6]，人絨毛促性腺激素（β-HCG）[7]、雌二醇（E2）和睪酮（T）均持續(xù)增加；同時米非司酮還可以下調(diào)蛻膜中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）與其受體的轉(zhuǎn)錄，提高血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平[8]。盧士燕等[9]報道，應用米非司酮后，CD56+特別是CD16+表達明顯增高，提示NK細胞表達增高，殺傷活性增強，在藥物流產(chǎn)中發(fā)揮一定作用。

總結(jié)以上的研究來看，藥物流產(chǎn)是一個多方面、多因素參與的過程。藥物流產(chǎn)雖然已經(jīng)在臨床開展了三十余年，但其終止早孕的機制仍不清楚。前列腺素受體在哺乳動物生殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵而復雜的調(diào)節(jié)作用。前列腺素參與卵泡排出的過程[10]，在胚胎植入過程中發(fā)揮重要作用[11]，在生產(chǎn)過程中多種前列腺素受體分別表達于子宮和子宮肌層來發(fā)揮各自不同的生物學作用[12]。雖然前列腺素受體在生殖領(lǐng)域發(fā)揮復雜的作用，但是前列素受體在藥物流產(chǎn)過程中的作用未見有報道。本研究選取我院的正常早孕、且主動要求選擇藥物流產(chǎn)終止妊娠的健康婦女作為研究對象，采用實時定量PCR技術(shù)檢測早孕蛻膜中FP、FP-V1和FP-V2表達的差異，探討其與藥物流產(chǎn)結(jié)局的關(guān)系，以便進一步為研究藥物流產(chǎn)的機制提供思路，為流產(chǎn)不全患者減少痛苦和困擾。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年6月～2015年3月遼寧省計劃生育科學研究院門診主動要求藥物流產(chǎn)終止正常妊娠的50例患者作為研究對象，所有患者在組織收集前均簽署知情同意書。蛻膜取自正常妊娠<49 d、經(jīng)B超診斷為宮內(nèi)妊娠、尿液妊娠試驗確診為陽性的健康藥物流產(chǎn)患者。根據(jù)流產(chǎn)是否完全分為完全組（30例）和不完全組（20例），兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2分組

1.2.1完全組 在米非司酮和米索前列醇用藥6 h內(nèi)，孕囊能夠完全排出。

1.2.2不完全組 在6 h內(nèi)不能排出孕囊或孕囊排出不完整。

1.3儀器及試劑

PCR儀（美國應用系統(tǒng)生物公司，Veriti 9902）；實時定量PCR儀（美國應用系統(tǒng)生物公司，ABI7000）；組織RNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，RN05）；逆轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA公司，DRR047S）；SYBR Premix Ex TagTMⅡ（TAKARA公司，DRR037A）。

1.4組織RNA提取

按照艾德萊組織RNA試劑盒的操作流程進行提取，提取的RNA置于-80℃冰箱備用。

1.5反轉(zhuǎn)錄及實時定量

反轉(zhuǎn)錄以組織RNA為模板，反應體系為：5×Buffer 2 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，RT Enzyme 0.5 μl，RNA 500 ng，RNase Free dH2O補足至10 μl。37℃ 30 min，85℃ 15 s。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，實時定量PCR的反應體系為：SYBR Prime Ex TaqTM 10 μl，PCR正反向引物各0.8 μl，ROXⅡ 0.4 μl，ddH2O 7 μl。反應參數(shù)為95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 31 s，共40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT相對定量的方法進行計算。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，對定量PCR結(jié)果采用單因素ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 FP-V2在人早孕蛻膜中的表達

隨機選取4例患者蛻膜組織，采用RT-PCR檢測方法檢測到FP-V2在人早孕蛻膜組織均有表達（圖1）。

2.2 FP、FP-V1和FP-V2在完全組和不完全組藥物流產(chǎn)蛻膜組織中的表達

不完全流產(chǎn)組蛻膜中FPmRNA（8.35±0.28）的表達明顯升高，是完全組（3.17±0.22）的2.63倍（P<0.05）（圖2A）。FP-V1 mRNA在完全組和不完全組蛻膜中的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖2B）。不完全流產(chǎn)組蛻膜中FP-V2 mRNA（11.32±0.88）的表達明顯升高，是完全組（4.51±0.46）的2.51倍（P<0.05）（圖2C）。

3討論

米非司酮配伍米索前列醇是一個成熟、有效的終止早孕的方法，但是仍有部分婦女承受藥物流產(chǎn)不完全（5%）、流血過多（3%）和繼續(xù)妊娠（1%）的困擾[13]。在米非司酮配伍米索前列醇流產(chǎn)過程中，陰道出血的風險也在升高[14]。雖然藥物流產(chǎn)在臨床中被廣泛應用，但是其是一個多因素參與的過程，主要機制仍不明確。此外，也有多種臨床標準如子宮內(nèi)膜厚度、藥物流產(chǎn)次數(shù)和β-hCG[15]等來判斷和預測流產(chǎn)的結(jié)局，但是，仍未找到一個準確、可靠的指標來指導臨床，因此，尋找一個明確的因素來預測藥物流產(chǎn)的結(jié)局至關(guān)重要。本研究擬從藥物流產(chǎn)的敏感性出發(fā)，來研究與藥物流產(chǎn)敏感性相關(guān)的因子，探索藥物流產(chǎn)的機制，更好地為臨床解決實際問題。

蛻膜是母-胎界面來自母體的重要組成部分，具有廣泛的生物學功能，除了具有營養(yǎng)支持作用外，還具有合成分泌、免疫調(diào)節(jié)等生物學功能，在妊娠過程中具有重要意義。同時蛻膜是PGF2α合成和代謝的主要場所，并且蛻膜也是其發(fā)揮作用的場所[16]。在早期妊娠過程中，米非司酮可以使PGF2α的合成增多，代謝減少。前列腺素FP受體子宮內(nèi)膜異位癥的血管生成增加[17]，生產(chǎn)過程中的子宮肌層增加[18]，前列腺素PGF2α在生產(chǎn)過程中是一個重要的生產(chǎn)啟動因素，但是在藥物流產(chǎn)方面未見報道。妊娠生產(chǎn)過程和藥物流產(chǎn)都是妊娠終止過程，前列腺素FP受體在生產(chǎn)過程有重要作用，那么從前列腺素FP受體入手，找到一個可以預知藥物流產(chǎn)結(jié)局的因素，可以為更好地研究和理解藥物流產(chǎn)機制提供思路。

前列腺素受體FP包含F(xiàn)P-V1和FP-V2兩個亞型，F(xiàn)P-V1亞型是傳統(tǒng)亞型，目前對其研究比較透徹；但是FP-V2亞型是一個新發(fā)現(xiàn)亞型，其功能幾乎未見報道。本研究選取4例早孕蛻膜，采用RT-PCR方法檢測到早孕蛻膜中均有FP-V2的表達，這與Hay等[19]的研究結(jié)果一致，提示FP-V2在人早孕蛻膜組織中有表達。其在蛻膜中大量特異性表達提示FP-V2可能參與妊娠的一些生理過程。此外，本研究還檢測到FP和FP-V2在不完全流產(chǎn)組蛻膜中的表達要明顯高于完全流產(chǎn)組，而FP-V1在兩組中無明顯差別，提示FP-V2在蛻膜中表達的升高與藥物流產(chǎn)的不完全有一定關(guān)聯(lián)性，這可能是影響藥物流產(chǎn)結(jié)局的一個因素。同時，總體的前列腺素FP受體在不完全組中的表達也升高，而FP-V1亞型的表達則無明顯變化，提示FP受體在不完全流產(chǎn)蛻膜中的這個升高可能也是由FP-V2的升高引起。

綜上所述，米非司酮配伍米索前列醇終止早孕是一個多因素參與的過程，在藥物流產(chǎn)的不完全組蛻膜中FP-V2表達升高，在完全組蛻膜中表達下降，提示FP-V2對于藥物流產(chǎn)過程是一個負向調(diào)節(jié)因素，其升高不利于藥物流產(chǎn)的完全性。關(guān)于FP-V2與藥物流產(chǎn)結(jié)局的關(guān)聯(lián)可以為更好地研究藥物流產(chǎn)機制提供思路和方向，同時對于FP-V2功能的進一步探究可能會藥物流產(chǎn)不完全提供一個潛在的分子靶點和診療依據(jù)。

[參考文獻]

[1]Fiala C，Gemzel-Danielsson K.Review of medical abortion using mifepristone in combination with a prostaglandin analogue[J].Contraception，2006，74（1）：66-86.

[2]Wang N，Zhao H，Han，W，et al.Association of the G2014G genotype in estrogen receptor 1 gene with failure of the mifepristone-induced termination of early pregnancy[J].Tohoku J Exp Med，2010， 220 （1）： 77-82.

[3]Sitruk-Ware R.Mifepristone and misoprostol sequential regimen side effects，complications and safety[J].Contraception，2006，74（1）：48-55.

[4]Feiteiro J，Mariana M，Verde I，et al.Genomic and nongenomic effects of mifepristone at the cardiovascular level：a review[J].Reprod Sci，2016.[Epub ahead of print]

[5]劉芳，于俊榮，李杰，等.復方米非司酮對人早孕蛻膜組織結(jié)構(gòu)和分泌的影響[J].生殖與避孕，2001，21（5）：293-298.

[6]Rekawiecki R，Kowalik MK，Kotwica J.Onapristone （ZK299） and mifepristone （RU486） regulate the messenger RNA and protein expression levels of the progesterone receptor isoforms A and B in the bovine endometrium[J].Theriogenology，2015， 84（3）：348-357.

[7]潘燕，劉子龍，朱長虹.米非司酮對早孕獼猴蛻膜和絨毛組織絨毛促性腺激素-β和Ⅳ型膠原的影響[J].中華男科學，2004，10（5）：358-361.

[8]孟春霞，孫曉溪，張慧娟，等.米非司酮對早孕絨毛、蛻膜的影響[J].生殖與避孕，2006，26（9）：567-574.

[9]盧士燕，吳瑞芳，王振海，等.米非司酮并米索前列醇終止早孕的蛻膜組織T淋巴細胞亞群及細胞因子的表達[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2001，36（10）：625-627.

[10]Kim SO，Duffy DM.Mapping PTGERs to the ovulatory follicle：regional responses to the ovulatory PGE2 signal[J].Biol Reprod，2016，95（2）：33.

[11]Kaczynski P，Kowalewski MP，Waclawik A.Prostaglandin F2alpha promotes angiogenesis and embryo-maternal interactions during implantation[J].Reproduction，2016，151（5）：539-552.

[12]Konopka CK，Glanzner WG，Rigo ML，et al.Responsivity to PGE2 labor induction involves concomitant differential prostaglandin E receptor gene expression in cervix and myometrium[J].Genet Mol Res，2015，14（3）：10877-10887.

[13]Jiang WX，He FF，Shen Q，et al.Factors related to completeness of medical abortion with mifepristone and misoprostol[J].J Chin Med Assoc，2016.[Epub ahead of print]

[14]Liang H，Gao ES，Chen AM，et al.Mifepristone-induced abortion and vaginal bleeding in subsequent pregnancy[J].Contraception，2011，84（6）：609-614.

[15]Parashar P，Iversen OE，Midboe G，et al.Medical abortion in the first trimester：the use of serum hCG and endometrial thickness as markers of completeness[J].Eur J Contracept Reprod Health Care，2007，12（4）：366-371.

[16]Makino S，Zaragoza DB，Mitchell BF，et al.Decidual activation：abundance and localization of prostaglandin F2alpha receptor （FP） mRNA and protein and uterine activation proteins in human decidua at preterm birth and term birth[J].Placenta，2007，28（5-6）：557-565.

[17]Rakhila H，Al-Akoum M，Doillon C，et al.Augmented angiogenic factors expression via FP signaling pathways in peritoneal endometriosis[J].J Clin Endocrinol Metab，2016， 101（12）：4752-4763.

[18]Anadol E，Kanca H，Yar AS，et al.Prostaglandin F receptor expression in intrauterine tissues of pregnant rats[J].J Vet Sci，2014，15（1）：125-131.

[19]Hay A，Wood S，Olson D，et al.Labour is associated with decreased expression of the PGF2alpha receptor （PTGFR） and a novel PTGFR splice variant in human myometrium but not decidua[J].Mol Hum Reprod，2010，16（10）：752-760.

（收稿日期：2016-10-15 本文編輯：祁海文）