隋博文王 達(dá)翟平平李明虎王 浩

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

·研究報(bào)告·

射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠氣道重塑及Th17/CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響及機(jī)制研究*

隋博文1王 達(dá)2翟平平2李明虎2王 浩2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

目的 探討射干麻黃湯干預(yù)哮喘小鼠后Th17/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg），TGF-β1蛋白表達(dá)的變化及其與氣道重塑之間的關(guān)系。方法 24只Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組，空白組（A組）、模型組（B組）、射干麻黃湯組（C組），每組8只。建立慢性哮喘小鼠模型后，分別給予不同干預(yù)方式，觀察霧化8周后肺組織氣道重塑程度并檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)、Th17細(xì)胞及CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比。結(jié)果B、C組激發(fā)8周小鼠支氣管管壁厚度、平滑肌厚度均較A組厚（P＜0.05），但C組較B組?。≒＜0.05）。B、C組相較于A組，Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比增高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比降低（P＜0.05）；C組較B組Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比增高程度減少 （P＜0.05），CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比降低程度減小（P＜0.05）。B組TGF-β1蛋白表達(dá)與A組比較均增加（P＜0.05），而C組TGF-β1蛋白表達(dá)與A組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組TGF-β1蛋白表達(dá)較B組TGF-β1蛋白降低（P＜0.01）。結(jié)論 射干麻黃湯可能通過抑制TGF-β1蛋白表達(dá)，減少哮喘小鼠Th17細(xì)胞數(shù)，增加CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/CD4+CD25+Treg的免疫紊亂從而延緩氣道重塑。

射干麻黃湯 哮喘小鼠 氣道重塑 Thl7細(xì)胞/CD4+CD25+Treg細(xì)胞 TGF-β1

哮喘主要表現(xiàn)為不同程度的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等［1］。近年來隨著家庭裝修等過敏原越來越多，哮喘發(fā)病率越來越高，在許多地區(qū)近10～20年哮喘患病率增高了1倍［2］，并且不同國(guó)家和地區(qū)間的哮喘流行差異極大。而有研究表明近10年來，我國(guó)哮喘發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升態(tài)勢(shì)［3］。哮喘是由于免疫異常所導(dǎo)致的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，氣道重塑是炎癥反復(fù)作用的結(jié)果，是哮喘難治的根本原因［4］。Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg的相互作用成為氣道重塑過程研究的熱點(diǎn)。射干麻黃湯出自《金匱要略》，是目前中醫(yī)臨床治療冷哮的常用方劑，能在一定程度上抑制氣道重塑［5］。本研究旨在觀察射干麻黃湯干預(yù)哮喘小鼠氣道重塑的變化過程中，Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞及TGF-β1蛋白表達(dá)變化，并進(jìn)行相關(guān)性分析，研究射干麻黃湯治療后，哮喘小鼠氣道重塑變化過程中上述指標(biāo)的相互關(guān)系，為揭示射干麻黃湯治療哮喘的機(jī)制提供新的思路和方法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只Balb/c雌性小鼠。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-004。4～6周齡，體質(zhì)量（15±2）g，SPF級(jí)環(huán)境，以不含過敏原的無菌食物及專用動(dòng)物飲水喂養(yǎng)。

1.2 藥物組成 射干、麻黃、生姜、法半夏各9 g，紫菀、款冬花各6 g，五味子、細(xì)辛各3 g，大棗3枚。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)sc-146）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；二步法免疫組化檢測(cè)試劑及濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；雞卵清蛋白（OVA，Ⅴ級(jí)）產(chǎn)于美國(guó)Sigma公司；RP-MI-1640為美國(guó) Gibco公司產(chǎn)品；抗小鼠單克隆抗體anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE為美國(guó)BD/Pharmin-gen公司產(chǎn)品；IL-17單克隆抗體（PE標(biāo)記）購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。超聲霧化吸入器BSW-2A由鞍山貝爾思科技有限公司生產(chǎn)；自制玻璃霧化箱：60 cm×50 cm×40 cm。Lecia DM 3000自動(dòng)化正置顯微鏡圖像采集系統(tǒng)德國(guó)Leica Microsystems公司提供。光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS U-LBD-2，日本生產(chǎn)。電子天平：Bs110型，Sartorius公司產(chǎn)品。FC500流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。電熱恒溫干燥箱，201-0A，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

1.4 造模與給藥 24只Balb/c雌性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：空白組（A組）、模型組（B組）和射干麻黃湯組（C組），每組8只。參照夏振煒的方法制備哮喘模型［6］：在實(shí)驗(yàn)的第0、14日，B、C組每只小鼠腹腔注射致敏混懸液0.2 mL（含20μg OVA和100 μg氫氧化鋁）致敏，A組等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。激發(fā)：第21日開始B、C組給2.5%OVA霧化吸入激發(fā)，約30 min，隔天1次，A組予等量0.9%氯化鈉注射液霧化。灌胃：C組每次霧化前給射干麻黃湯（4.1 g/mL）灌胃，A、B組等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。射干麻黃湯灌胃劑量，以患者用量為基礎(chǔ)，根據(jù)人單位體表面積用量換算出小鼠單位體表面積用量，參照 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》一書中“人與動(dòng)物及各類動(dòng)物間藥物劑量的換算方法”計(jì)算。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 每組在霧化8周后頸部脫臼處死，取肺組織及脾臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。1）小鼠支氣管管壁、平滑肌厚度測(cè)量。常規(guī)石蠟包埋肺組織，HE染色制成病理切片來觀察、測(cè)量支氣管基底周徑（Pbm）、總管壁厚度（Wat）及平滑肌厚度（Wam），以Imagepro6.0圖像分析系統(tǒng)分析測(cè)定。2）Th17細(xì)胞/CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例檢測(cè)。將取下的脾臟組織入PRMI1640培養(yǎng)液沖洗，剪碎，研磨，過濾，加分離液，制成單核細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。3）TGF-β1檢測(cè)。以免疫組化PV二步法染色檢測(cè)，肺組織切片常規(guī)脫蠟到水，PBS沖洗，微波修復(fù)，滴加一抗，PBS沖洗。滴加二抗，37℃孵育，PBS沖洗。DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。組織切片中染成棕黃色者為陽性。每張切片于200倍光鏡下采集5個(gè)具有代表性的互不重疊視野，應(yīng)用上述圖像分析軟件測(cè)量每個(gè)視野的光密度（OD），以O(shè)D數(shù)值大小反映TGF-β1相對(duì)表達(dá)的多少。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。Pearson直線相關(guān)性對(duì)雙變量間進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠支氣管管壁、平滑肌厚度比較 見表1。結(jié)果示，B、C組激發(fā)8周小鼠支氣管管壁厚度、平滑肌厚度均較A組厚（P＜0.05）；但C組較B組?。≒＜0.05）。

表1 各組小鼠支氣管管壁、平滑肌厚度比較（μm，±s）

表1 各組小鼠支氣管管壁、平滑肌厚度比較（μm，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 支氣管管壁 平滑肌A組 8 45.35±6.64 5.58±0.91 B組 6 99.57±7.16*10.26±1.80*C組 7 55.59±7.31*△7.96±0.42*

2.2 各組小鼠脾組織中Th17細(xì)胞/CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的百分比比較 見表2。結(jié)果示，B、C組相較于A組，Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比增高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比降低（P＜0.05）；C組較B組Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比增高程度減少（P＜0.05）；CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比降低程度減?。≒＜0.05）。

2.3 各組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的密度值水平比較 見表3。結(jié)果示，B組TGF-β1蛋白表達(dá)與A組比較均增加 （P＜0.05），C組TGF-β1蛋白表達(dá)較

表2 各組小鼠Th17細(xì)胞/CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞百分比細(xì)胞的表達(dá)百分比比較（%，±s）

表2 各組小鼠Th17細(xì)胞/CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞百分比細(xì)胞的表達(dá)百分比比較（%，±s）

?

表3 各組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的密度值水平比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的密度值水平比較（±s）

B組TGF-β1降低（P＜0.05）。

組別 n TGF-β1蛋白表達(dá)的密度值A(chǔ)組 8 0.1410±0.0109 B組 6 0.1691±0.0150*C組 7 0.1524±0.0084△△

2.4 射干麻黃湯組中各檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析

見表4，表5。結(jié)果示，組織懸液中Th17細(xì)胞數(shù)與肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)與肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

表4 Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TGF-β1蛋白表達(dá)與氣道形態(tài)學(xué)改變的相關(guān)性分析

表5 Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Treg與TGF-β1蛋白的相關(guān)性分析

3 討 論

哮喘是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，涉及多種炎癥細(xì)胞及介質(zhì)參與，其中T細(xì)胞在哮喘的炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用［7-8］。近年研究者發(fā)現(xiàn)Th17/CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫紊亂在哮喘發(fā)生發(fā)展和疾病過程中起著重要作用，會(huì)導(dǎo)致氣道壁增厚，上皮下纖維化等。TGF-β1蛋白是哮喘發(fā)病過程中重要細(xì)胞因子之一。研究認(rèn)為TGF-β1蛋白是氣道重塑的主要媒介之一，其可通過影響氣道周圍血管增生、上皮下纖維化等不同方式參與氣道重塑的發(fā)生［9］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白可直接誘導(dǎo)Treg細(xì)胞上Foxp3+的表達(dá)促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而調(diào)節(jié)肺黏膜的免疫應(yīng)答［10］。射干麻黃湯出自《金匱要略》，常用來治療哮證急性發(fā)作期冷哮，臨床療效確切。有研究表明射干麻黃湯不僅能夠有效緩解哮喘癥狀，且有減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性的作用［11-12］。有學(xué)者研究顯示射干麻黃湯應(yīng)用后可抑制炎癥反應(yīng)，阻止氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞增生及抑制上皮下纖維化，有效抑制氣道重塑［13］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)用射干麻黃湯干預(yù)哮喘小鼠后，其哮喘的癥狀有所改善，平滑肌增生面積均低于模型組［14］。以上研究結(jié)果表明射干麻黃湯確實(shí)能夠改善哮喘模型小鼠氣道重塑情況。張麗等研究顯示在使用射干麻黃湯2周后肺組織小氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少，在使用8周后明顯減少［15］。

本研究結(jié)果顯示，射干麻黃湯組小鼠脾組織懸液中Th17細(xì)胞數(shù)、TGF-β1蛋白與氣道管壁厚度以及氣道平滑肌厚度呈正相關(guān)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞與氣道管壁厚度以及氣道平滑肌厚度呈負(fù)相關(guān)。脾組織懸液中Th17細(xì)胞數(shù)與肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)與肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示給予射干麻黃湯干預(yù)哮喘小鼠后體內(nèi)TGF-β1的變化可影響Thl7以及CD4++CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)變化。結(jié)果表明使用射干麻黃湯8周后哮喘小鼠氣道總管壁厚度和平滑肌細(xì)胞厚度較模型組明顯減輕，與之前研究結(jié)果一致，表明射干麻黃湯能夠抑制哮喘小鼠氣道重塑。故推測(cè)射干麻黃湯可能通過抑制TGF-β1表達(dá)來減少哮喘小鼠Th17細(xì)胞數(shù)，增加CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/CD4+CD25+Treg的免疫紊亂從而延緩哮喘小鼠模型氣道重塑。

因此，射干麻黃湯可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)來調(diào)節(jié)Th17/CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫平衡紊亂，來延緩哮喘小鼠氣道重塑，但其具體作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

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The Research of Influence and Mechanism of Shegan Mahuang Decoction on Intervention of Th17/CD4+CD25+Treg Cell in Airway Remodeling in Asthmatic Mice

SUI Bowen，WANG Da，ZHAI Pingping，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective：To discuss protein variation of Th17 ce11s/CD4+CD25+regulatory T cells，TGF-betal and the relationship between it and airway remodeling after Shegan Mahuang decoction intervention in asthmatic mice. Methods：24 Balb/c mice were randomly divided into three groups（8 per group），the blank group（group A），asthma group（group B），and Shegan Mahuang decoction group（group C）.The mice models of asthma underwent with different therapy after establishment.The airway remodeling was observed；the expression of TGF-β1 protein was measured and the percentage of Th17，CD4+CD25+regulatory T cells in CD4+T cells was detected after atomization for 8 weeks.Results：Compared with group A，the thickness of bronchial wall and smooth muscle，the number of Th17 cells and the expression of TGF-β1 protein were higher in group B and C（P＜0.05），while the number of CD4+CD25+Treg cells was lower in group B and C（P＜0.05）.The change in group C was less than that of group B（P＜0.05）.The change of TGF-β1 protein was particularly significant in group B（P＜0.05），but was not significant in group C（P＞0.05），and lower than that of group B（P＜0.01）.Conclusion：Shegan Mahuang decoction can reduce the expression of TGF-β1 protein and the number of Th17 cells，increase the number of CD4+CD25+Treg cells，and improve the immunologic derangement of Th17/CD4+CD25+Treg in asthmatic mice，so it can delay the occurrence of airway remodeling.

Shegan Mahuang decoction；Asthma mice；Airway remodeling；Th17/CD4+CD25+cells regularoty T cells；TGF-β1

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0204-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.006

2016-10-10）

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H201317）