嚴美婷，杜霞，邱醒，張超鳳，李海閩，吳國平，陳衛(wèi)平*

(江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

中式納豆制備技術的研究

嚴美婷，杜霞，邱醒，張超鳳，李海閩，吳國平，陳衛(wèi)平*

(江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

為探索出符合中國人口味且納豆激酶酶活力高的中式納豆加工技術，該研究從市售的4種納豆中分離出4株納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto），并篩選出一株產(chǎn)納豆激酶能力最強的菌株NK3。以牛奶培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆菌種，通過單因素試驗考察發(fā)酵溫度、時間、接種量、加水量對納豆激酶酶活力的影響，采用正交試驗優(yōu)化納豆發(fā)酵條件。結果表明，以牛奶為培養(yǎng)基培養(yǎng)的納豆菌生長良好，在發(fā)酵溫度27℃、發(fā)酵時間1.5 d、接種量5%、加水量6%條件下，菌株NK3發(fā)酵制備出的納豆無氨臭味，有淡淡的奶香味，且納豆激酶酶活力高達668.5 U/g。

納豆；納豆芽孢桿菌；納豆激酶；牛奶培養(yǎng)基

納豆是一種在日本具有2 000多年悠久歷史的營養(yǎng)食品，它是將大豆煮熟后，接種納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發(fā)酵后而形成的發(fā)酵型食品[1-3]。納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生納豆激酶，此酶具有較強的纖溶活性，能有效預防和治療心腦血管疾病[4]。

近年來，隨著我國居民生活水平的日益提高，心腦血管疾病的患者人數(shù)也日益增多，雖然市面上現(xiàn)有許多治療心腦血管疾病的藥品，但其副作用大[5]。有研究表明，因納豆中含有納豆激酶，長期食用納豆能有效預防和治療心腦血管疾病，而且還有助消化、抗癌、抗氧化和延緩衰老以及壯體強身、護肝美容、預防感冒和防止醉酒等功效[6-9]。因此，探究納豆的發(fā)酵工藝，以提高納豆中納豆激酶的活力，改善納豆的口感風味，從而提高納豆的營養(yǎng)和保健功能，有著非常廣泛的發(fā)展前景。并且目前我國的大豆生產(chǎn)加工存在附加值低的現(xiàn)象，因而將大豆進一步深加工發(fā)酵納豆，符合農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化及高附加值要求[10]。目前國內(nèi)納豆生產(chǎn)多采用日本納豆的發(fā)酵工藝，一般用傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基（即牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基）擴大培養(yǎng)納豆芽孢桿菌菌種，在37～40℃條件下短時間發(fā)酵生產(chǎn)納豆[10]。然而采用上述條件制備出的納豆會產(chǎn)生很難聞的發(fā)酵氨味，較難被大多數(shù)中國人所接受，且納豆激酶的活力也不高。如今，符合中國人口味的中式納豆（即無發(fā)酵氨臭味）的制備技術研究較少。

本研究通過從市售的4種納豆中分離篩選出一株產(chǎn)納豆激酶酶活力較強的菌株，通過用牛奶培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)納豆菌，并對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的條件進行優(yōu)化，擬尋找出一條最佳的、符合中國人口味的中式納豆發(fā)酵工藝條件。以期改善納豆菌固態(tài)發(fā)酵納豆的氣味，生產(chǎn)出無氨臭味、口感風味良好、納豆激酶酶活力高的中式納豆。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和原料

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）NK1、NK2、NK3、NK4：分別從市售的燕京納豆、大連美屋納豆、日本鶴子一番納豆、日本道后納豆中分離純化而來。

脫脂乳粉（蛋白質(zhì)含量為32.6%）、黃豆：市售。

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉（生化試劑）、福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；酪蛋白（分析純）：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，瓊脂1.8%，pH 7.0～7.4，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀0.4%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0～7.4，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

基礎牛奶培養(yǎng)基[11]：脫脂乳粉12%，葡萄糖0.5%，pH 7.0～7.4，112℃、0.07 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AR2140電子分析天平：奧豪斯有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；NSKY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司；T22型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；MJ-54A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設備有限公司；DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)納豆激酶的納豆芽孢桿菌優(yōu)選

從市售的4種納豆中分離出4株納豆芽孢桿菌[4]，分別編號為NK1、NK2、NK3、NK4。將這4株活化好的納豆芽孢桿菌分別接入種子液培養(yǎng)基中，置于搖床上35℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)18 h制成種子液。然后在無菌條件下，以5%的接種量將種子液接入已蒸煮滅菌的黃豆中，并加入7%的無菌水均勻攪拌，置于32℃恒溫箱中發(fā)酵2 d制成納豆[12]。采用福林酚法測定納豆中的納豆激酶酶活[13-15]，每組試驗做3個重復，篩選出產(chǎn)酶活最高的菌株。

1.3.2 牛奶種子培養(yǎng)基的選擇

將基礎牛奶培養(yǎng)基中的脫脂乳粉含量設置為8%、10%、12%、14%、16%，然后將優(yōu)勢菌株NK3菌分別接入牛奶培養(yǎng)基（裝液量為50 mL/250 mL）及傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基（對照組）中進行擴大培養(yǎng)。每組試驗做3個重復，采用稀釋平板涂布法計數(shù)[16]，以活菌數(shù)為指標，考察牛奶培養(yǎng)基中脫脂乳粉含量對納豆菌NK3生長的影響，并對比該菌在牛奶培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基中生長的情況。

1.3.3 單因素試驗優(yōu)化

將菌株NK3種子液均勻地拌入已蒸煮滅菌的黃豆中，在一定的發(fā)酵條件下進行納豆發(fā)酵，分別考察發(fā)酵溫度（24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃）、接種量（以黃豆?jié)褓|(zhì)量計）（3%、4%、5%、6%、7%）、加水量（以黃豆?jié)褓|(zhì)量計）（3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）對納豆中納豆激酶酶活的影響。每組試驗做3個重復，測定成品納豆中納豆激酶酶活，以確定最適的發(fā)酵條件。

1.3.4 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，選取發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、加水量（C）、發(fā)酵時間（D）為因素，以納豆激酶酶活為考察指標，進行正交優(yōu)化試驗。正交試驗因素與水平見表1。

表1 納豆發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for natto fermentation conditions optimization

為考察本研究納豆發(fā)酵條件的優(yōu)化效果，分別采用優(yōu)化前后納豆發(fā)酵工藝發(fā)酵制備納豆，比較優(yōu)化前后納豆的感官品質(zhì)及納豆激酶酶活，并與4種市售納豆（燕京納豆、大連美屋納豆、日本鶴子一番納豆、日本道后納豆）進行對比。感官評分滿分為100分，感官評價標準見表2。

表2 納豆感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of natto

2 結果與分析

2.1 高產(chǎn)納豆激酶納豆芽孢桿菌的優(yōu)選

將4株納豆芽孢桿菌種子液接種至已蒸煮滅菌的黃豆中制備納豆，測定納豆中的納豆激酶酶活，測定結果見圖1。

由圖1可知，納豆芽孢桿菌NK4發(fā)酵的納豆中的納豆激酶酶活最低，而由菌株NK3發(fā)酵的納豆中的納豆激酶酶活最高，為497.1 U/g，且經(jīng)測定4株菌株分別所對應的原始樣品納豆（燕京納豆、大連美屋納豆、日本鶴子一番納豆、日本道后納豆）中的納豆激酶酶活分別為369.4 U/g、451.8 U/g、460.5 U/g、322.7 U/g，均比菌株NK3發(fā)酵的納豆中的納豆激酶酶活低，因此說明菌株NK3的發(fā)酵性能好。故在后續(xù)試驗中將選取納豆芽孢桿菌NK3作為納豆發(fā)酵的發(fā)酵菌株。

圖1 不同菌株對納豆激酶酶活的影響Fig.1 Effect of different strains on nattokinase activity

2.2 牛奶種子培養(yǎng)基的選擇

將優(yōu)勢菌株NK3接入牛奶培養(yǎng)基，考察牛奶培養(yǎng)基中脫脂乳粉含量對菌株NK3活菌數(shù)的影響，結果見圖2。

圖2 培養(yǎng)基中脫脂乳粉含量對菌株生長的影響Fig.2 Effect of skimmed milk powder content in culture medium on the strains growth

由圖2可知，隨著牛奶培養(yǎng)基中脫脂乳粉含量的增加，種子液中納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當脫脂乳粉含量為14%時，各營養(yǎng)物質(zhì)豐富，菌體生長旺盛，大量繁殖，活菌數(shù)達到了8.2×109CFU/mL，而對照組中的活菌數(shù)為1.5×109CFU/mL。表明納豆芽孢桿菌在脫脂乳粉含量為14%的牛奶培養(yǎng)基中生長良好，因此可以用含14%脫脂乳粉的牛奶培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種。

2.3 單因素試驗發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

選用不同的發(fā)酵溫度對納豆芽孢桿菌NK3進行發(fā)酵，其納豆中納豆激酶酶活檢測結果見圖3。

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，納豆激酶酶活先上升后下降，其中在39℃條件下發(fā)酵的納豆中納豆激酶酶活最低，可能是由于溫度較高，納豆芽孢桿菌生長代謝旺盛，代謝產(chǎn)物積累過多，從而使納豆激酶酶活降低。而在27℃條件下溫度適宜，發(fā)酵的納豆激酶的酶活最高，達到了525.6 U/g。因此，最佳的發(fā)酵溫度應為27℃。

圖3 發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.3.2 接種量對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

選用不同的接種量對納豆芽孢桿菌NK3進行發(fā)酵，其納豆中納豆激酶酶活檢測結果見圖4。

圖4 接種量對納豆激酶酶活的影響Fig.4 Effect of inoculum on nattokinase activity

由圖4可知，隨著接種量的增加，納豆激酶酶活呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢?？赡茉蚴钱斀臃N量太低時，納豆芽孢桿菌過少，延長菌體延遲期，使納豆發(fā)酵不充足，導致酶活較低；而接種量過高時，菌體密度大，納豆菌生長過快，衰老細胞增加，發(fā)酵后勁不足，影響了納豆激酶的合成。當接種量為5%時，發(fā)酵的納豆中的納豆激酶酶活最高，達到515.1 U/g。因此，選擇接種量5%為宜。

2.3.3 加水量對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

選用不同的加水量對納豆芽孢桿菌NK3進行發(fā)酵，其納豆中納豆激酶酶活檢測結果見圖5。

由圖5可知，隨著加水量的增加，納豆激酶酶活呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當加水量為7%時發(fā)酵的納豆激酶酶活最高，高達510.6 U/g；在加水量＜7%時，發(fā)酵的納豆中的納豆激酶酶活比較低，可能是由于含水量較低時大豆吸水不充分，初期出現(xiàn)了小黃豆干癟的情況，水分供應不足，納豆比較松散，拉絲物質(zhì)少黏性差，各部分的營養(yǎng)物質(zhì)傳遞不均勻[17]，限制納豆菌的生長，從而呈現(xiàn)納豆激酶酶活隨著加水量的增加而增大的趨勢；而當加水量＞7%時酶活開始下降，可能是由于當含水量較高時，氧氣供應不充足，影響納豆菌的生長，從而使表面和底部發(fā)酵不均勻，導致納豆激酶酶活偏低。因此，選擇加水量7%為宜。

圖5 加水量對納豆激酶酶活的影響Fig.5 Effect of water addition on nattokinase activity

2.3.4 發(fā)酵時間對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

選用不同的發(fā)酵時間對納豆芽孢桿菌NK3進行發(fā)酵，其納豆中納豆激酶酶活檢測結果見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對納豆激酶酶活的影響Fig.6 Effect of fermentation time on nattokinase activity

由圖6可知，發(fā)酵時間為1 d時，由于發(fā)酵不夠完全，納豆激酶酶活較低；培養(yǎng)時間為2 d時發(fā)酵的納豆激酶酶活達到最高，為516.1 U/g；再延長發(fā)酵時間會降低納豆激酶酶活，可能是由于發(fā)酵時間太長，代謝產(chǎn)物積累，導致酶活降低。因此，選擇發(fā)酵時間2 d為宜。

2.4 正交優(yōu)化試驗結果

用DPS v6.55版統(tǒng)計軟件對正交試驗所得數(shù)據(jù)進行分析處理，正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

由表3極差分析結果可知，RA＞RD＞RB＞RC，即各因素對試驗指標影響大小為A＞D＞B＞C，通過直觀分析得到較佳方案為A2B2C1D1。由表4方差分析表可知，發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵時間對納豆激酶酶活的影響顯著（P＞0.05），而接種量、加水量對納豆激酶酶活的影響不顯著。因此綜合極差分析和方差分析結果可得出最優(yōu)方案為A2B2C1D1。由于在上述正交試驗中的9個試驗組中沒有出現(xiàn)該最佳組合，因此需要進行驗證試驗。

采用組合A2B2C1D1發(fā)酵后納豆中納豆激酶酶活達668.5 U/g，因此最佳發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為27℃、接種量5%、加水量6%、發(fā)酵時間1.5 d。

表3 納豆發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for natto fermentation optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5 納豆發(fā)酵對比試驗

采用優(yōu)化前后納豆發(fā)酵工藝技術發(fā)酵制備納豆，檢測納豆的感官品質(zhì)及納豆激酶酶活，并與4種市售納豆進行對比，其檢測結果見表5。

表5 納豆發(fā)酵對比試驗結果Table 5 Result of natto fermentation comparison experiments

由表5可知，經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵的納豆感官品質(zhì)優(yōu)質(zhì)，納豆激酶酶活高達668.5 U/g，比優(yōu)化前及市售的4種納豆中的納豆激酶酶活均高。并且對優(yōu)化后發(fā)酵的納豆進行感官品評發(fā)現(xiàn)納豆無氨味，無后苦味，并且?guī)в械哪滔阄?，這可能與用牛奶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種有關。發(fā)酵的納豆感官品質(zhì)比目前市售的納豆均好，更符合國內(nèi)消費者的口味。

3 結論

本研究從市售的4種納豆中分離篩選出一株產(chǎn)納豆激酶能力較強的菌株NK3，此菌株發(fā)酵的納豆激酶酶活均高于市售的4種納豆，且該菌株在含14%脫脂乳粉的牛奶培養(yǎng)基中生長良好，故采用含14%脫脂乳粉的牛奶培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆芽孢桿菌NK3。通過單因素及正交試驗優(yōu)化納豆的發(fā)酵工藝，得出了最佳的納豆制備工藝條件為發(fā)酵溫度為27℃，發(fā)酵時間為1.5 d，接種量為5%，加水量為6%。在此條件下發(fā)酵出的納豆中的納豆激酶酶活達668.5 U/g，遠高于優(yōu)化前（485.0 U/g）的酶活，且納豆的感官品質(zhì)優(yōu)良，無不良氣味與口感，帶有淡淡的奶香味，符合國內(nèi)大多數(shù)消費者的口味，是更易被中國人所接受的中式納豆。為中式納豆發(fā)酵工藝的研究提供了理論基礎。

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Research of Chinese natto preparation technology

YAN Meiting,DU Xia,QIU Xing,ZHANG Chaofeng,LI Haimin,WU Guoping,CHEN Weiping*
(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In order to explore process technology of Chinese natto which was conform to Chinese people taste and had high nattokinase activity,the fourBacillus nattowere isolated from four kinds of commercial natto.A high nattokinase-producing strain NK3was obtained,and theB.nattowas cultured using the milk culture medium to replace the traditional seed liquid culture medium.The effects of fermentation temperature,time,inoculum and water addition on nattokinase activity were investigated by single factor experiment.The natto fermentation conditions were optimized by orthogonal experiments.The results showed that theB.nattogrew well in the milk culture medium.Under the conditions of fermentation temperature 27℃,time 1.5 d,inoculum 5%and water addition 6%,the natto fermented by strain NK3had no ammonia smell with light milk fragrance,and the nattokinase activity reached 668.5 U/g.

natto;Bacillus natto;nattokinase;milk culture medium

TQ920.1

0254-5071（2017）02-0175-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.038

2016-09-06

國家自然科學基金項目（31560480）

嚴美婷（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：陳衛(wèi)平（1958-），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。