劉冰，葛謙*，張艷，茍春林，趙子丹

(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所，寧夏銀川750002）

HPLC法同時測定葡萄和葡萄酒中6種基本花色苷

劉冰，葛謙*，張艷，茍春林，趙子丹

(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所，寧夏銀川750002）

該研究建立了高效液相色譜法同時測定葡萄和葡萄酒中6種基本花色苷的檢測方法。樣品經(jīng)無水乙醇/鹽酸/水（2∶1∶1,V/V）提取，采用Agilent-ZORBAXSB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）為固定相，流動相A（乙腈）和B（0.1%磷酸水溶液）梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長525 nm。在該色譜條件下，6種花色苷在30 min內(nèi)得到了很好的分離效果，其含量與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R＞0.9993），且回收率為82.2%～93.3%、精密度好（RSD＜5.0%）。該方法方便、快速，能夠?qū)崿F(xiàn)對葡萄和葡萄酒中6種花色苷物質(zhì)的定性及定量檢測。

花色苷；高效液相色譜；葡萄；葡萄酒；檢測

花色苷在自然界中常以糖苷形式存在，是由花色素與葡萄糖相結(jié)合而生成的糖苷類化合物[1]?；ㄉ罩饕形宸N基本形式：飛燕草花色素苷、錦葵花色素苷、芍藥花色素苷、矢車菊花色素苷和矮牽?；ㄉ剀誟2]?；ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)可以分為四大類：基本花色苷（非?；ㄉ眨?、?；ㄉ?、聚合花色苷和吡喃花色苷[3-6]?；ㄉ兆鳛槠咸丫浦饕噬镔|(zhì)，使其呈現(xiàn)出紅色、磚紅色、紫紅色等不同顏色，對葡萄酒的感官品質(zhì)起到?jīng)Q定性作用[7-9]。葡萄中，花色苷主要存在于紅色、紫色葡萄漿果皮中最靠近表皮3～4層細(xì)胞的液泡中[10-11]。葡萄酒中花色苷的組成特征蘊含了產(chǎn)地、品種、年份以及釀酒工藝等信息，可作為區(qū)分不同品種紅葡萄酒的化學(xué)標(biāo)志。因此，分析葡萄及葡萄酒中花色苷尤顯重要[12]。

目前對于花色苷含量的測定，主要有pH值差異法、比色法以及高效液相色譜法[13]。其中比色法操作繁瑣，且容易受到其他酚類物質(zhì)干擾而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而高效液相色譜法具有樣品用量少、方法操作簡單并且能夠準(zhǔn)確對單一組分進行定性和定量等優(yōu)點而被廣泛使用[14-16]。本試驗前處理結(jié)合頂空瓶密封加熱的方法，大幅度提高了樣品前處理速度，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法能適應(yīng)國內(nèi)大部分實驗室檢測要求，建立了相對快速、便捷、穩(wěn)定的檢測方法。以期為葡萄酒相應(yīng)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了理論依據(jù)，為釀酒工藝的改良提供了重要數(shù)據(jù)支撐[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠干紅葡萄酒（2008年）、霞多麗干白葡萄酒（2008年）：寧夏志輝源石酒莊。釀酒葡萄取自銀川市蘆花臺園林場，將樣品在室溫下進行打漿、去葡萄籽處理。

標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷（cyaniding-3-O-glucoside）、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucosi de）、飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside）、矮牽牛色素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside）、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）、天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（pelargonidin-3-O-glucoside）：美國Chromadex公司。

將購得的標(biāo)準(zhǔn)品分別用鹽酸/甲醇（1∶9，V/V）配制成100 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-20℃。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；無水乙醇、磷酸（均為分析純）、鹽酸（優(yōu)級純）：上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀（配2475紫外檢測器及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：美國Waters公司；凱航HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市凱航儀器有限公司；FRQ-1006單槽超聲波清洗機：杭州法蘭特超聲波科技有限公司；Mili-Q型超純水機：美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Agilent-ZORBAXSB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：40℃；檢測波長：525 nm；流動相：A乙腈；B 0.1%磷酸水溶液；流速：0.8 mL/min，梯度洗脫；進樣體積：5 μL，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2 樣品預(yù)處理

稱取5.00 g葡萄酒于100 mL頂空瓶中，加入無水乙醇/鹽酸/水（2∶1∶1，V/V）提取劑25 mL，搖勻后用壓蓋器將瓶蓋壓緊密封，超聲30 min后于100℃沸水浴1 h。取出樣品冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

釀酒葡萄樣品預(yù)處理方法同葡萄酒預(yù)處理方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

用紫外分光光度計對6種花色苷標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進行全波掃描。結(jié)果顯示，6種標(biāo)準(zhǔn)樣品最大吸收峰雖然各不相同，但在波長525 nm處均有最大或者較大吸收峰。因此，本試驗選擇525 nm作為儀器的檢測波長。

2.2 流動相條件的確定

根據(jù)所查文獻[7，15，18]，本試驗對3種流動相組成進行了優(yōu)選。

流動相Ⅰ：流動相A：乙腈∶水（60∶40，V/V），流動相B：乙腈∶水（5∶95，V/V）（均使用磷酸調(diào)pH=1.5）。洗脫程序為梯度洗脫：0～10 min，5%～10%A，10～25 min，10%～25%A；25～26 min，25%～5%A，30 min，5%A。柱溫：40℃；檢測波長：525 nm；流速：0.8 mL/min，進樣體積：5 μL。

流動相Ⅱ：流動相A：乙酸∶水（2∶98，V/V），流動相B：乙腈。洗脫程序為梯度洗脫：0～10 min，16%B，10～25 min，20%～40%B；25～30 min，40%～0%B。柱溫：40℃；檢測波長：525 nm；流速：0.8 mL/min，進樣體積：5 μL。

流動相Ⅲ：流動相A：水∶乙酸∶乙腈=（89∶2∶9，V/V），流動相B：水∶乙腈（20∶80，V/V）。洗脫程序為等度洗脫。柱溫：40℃；檢測波長：525nm；流速：0.8mL/min，進樣體積：5μL。

流動相Ⅳ：A：乙腈；B：0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫：0～25min：10%～25%A，25～25.1min：25%～10%A。柱溫：40℃；檢測波長：525nm；流速：0.8mL/min，進樣體積：5μL。

結(jié)果表明：采用流動相Ⅰ時，各花色苷峰形較尖但有拖尾，且分離效果較差；采用流動相Ⅱ時，各花色苷峰形較寬，分離效果較差，尤其芍藥色素-3-O-葡萄糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷無法很好分離；采用流動相Ⅲ時，各花色苷分離效果較差、響應(yīng)值較低且分離時間長。采用流動相Ⅳ時，各花色苷分離效果較好、且保留時間較短。綜合各方面因素，本試驗選用流動相Ⅳ進行實驗。

2.3 前處理方法的選擇

分別選用超聲波法、不同溫度（25℃、60℃、80℃、100℃、120℃）、不同時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h）水浴振蕩法、鹽酸、磷酸等提取手段，結(jié)果表明，超聲波法雖然能夠很好將樣品內(nèi)溶物溶出于提取溶劑中，但花色苷需在酸性條件下，且進行加熱處理，才能很好顯色。加熱的長短對本試驗影響不大，用鹽酸進行pH調(diào)酸處理較磷酸更穩(wěn)定，因此，本試驗最終選擇無水乙醇/鹽酸/水（2∶1∶1，V/V）為提取試劑，超聲30 min（50 kHz、120 W），100℃加熱1 h為樣品前處理方法。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的確定

采用外標(biāo)峰面積定量，混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖見圖1。

圖16 種花色苷混合標(biāo)樣高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of six anthocyanins mixture standard samples

分別將6種花色苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液稀釋成5.0 mg/kg、10.0 mg/kg、50.0 mg/kg、80.0 mg/kg、100 mg/kg個質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種花色苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（detection limit，LOD）結(jié)果見表2。由表2可知，6種花色苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R值＞0.9993，各方法檢出限較低（0.008～0.010mg/kg），該方法對花色苷檢測顯示了較高的靈敏度。

表26 種花色苷回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of six anthocyanins

2.5 精密度及回收率試驗

以2.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg 3個質(zhì)量濃度為添加水平，每個水平重復(fù)5次，在霞多麗白葡萄和葡萄酒（本底值均為0）中添加相應(yīng)濃度6種花色苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫靜置30 min后，按照1.3.1和1.3.2方法，測定釀酒葡萄和葡萄酒中6種花色苷含量，結(jié)果見表3。

表3 精密度及加標(biāo)回收率試驗結(jié)果(n=5)Table 3 Results of precision and adding standard recovery rate tests(n=5)

由表3可知，釀酒葡萄和葡萄酒中6種花色苷測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）在1.1%～4.5%，均＜5.0%；回收率為82.2%～93.3%，均在80%～110%之間。結(jié)果表明，該方法精密度、準(zhǔn)確度較高。

2.6 樣品測定

圖2 赤霞珠釀酒葡萄(A)及葡萄酒(B)中5種花色苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of five anthocyanins in Cabernet Sauvignon grape(A)and wine(B)

在相同實驗條件下對葡萄和葡萄酒樣品中6種花色苷含量進行分析，葡萄和葡萄酒樣品中6種花色苷含量高效液相色譜圖見圖2，結(jié)果見表4。

表4 釀酒葡萄和葡萄酒中花色苷含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 Determination results of anthocyanins contents in grape and wine(n=3)

由表4可知，在釀酒葡萄和葡萄酒中，各花色苷含量差別大。釀酒葡萄中主要花色苷為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷，葡萄酒中主要花色苷為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷。在釀酒葡萄和葡萄酒中，西拉和美樂花色苷含量整體高于赤霞珠品種，天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷均未檢出，這與文獻[10]報道不同品種山葡萄酒中花色苷的組成與含量基本一致。在釀酒葡萄中，西拉錦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量最高為39.3 mg/kg，美樂次之為34.7mg/kg，赤霞珠最低為2.0 mg/kg。在葡萄酒中，美樂錦葵色素-3-O-葡萄糖苷最高為104.5 mg/kg，西拉次之為103.0 mg/kg，赤霞珠最低為79.9 mg/kg。葡萄酒中5種花色苷含量均高于釀酒葡萄。

3 結(jié)論

本試驗采用高效液相色譜對釀酒葡萄及葡萄酒種6種花色苷進行分析測定，6種花色苷在30 min內(nèi)完全分離。在一定線性范圍內(nèi)，各分析物有良好的線性關(guān)系(R值≥0.999 3)和較低的方法檢出限(0.008～0.010 mg/kg)，回收率在82.2%～93.3%，RSD＜4.5%。該方法操作簡單快速，靈敏度高，準(zhǔn)確度良好，可以作為建立花色苷指紋圖譜較好的手段。

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Simultaneous determination of six kinds of basic anthocyanins in grape and wine by HPLC

LIU Bing,GE Qian*,ZHANG Yan,GOU Chunlin,ZHAO Zidan
(Quality Standards and Testing Institute of Agricultural Technology,Yinchuan 750002,China)

The method for simultaneous determination of six kinds of basic anthocyanins in grape and wine by HPLC was established.The simple was extracted by ethanol/hydrochloric acid/water(2∶1∶1,V/V),separated by Agilent-ZORBAX SB-C18chromatographic column(250 mm×4.6 mm,5 μm), with acetonitrile and 0.1%phosphoric acid solution as mobile phase,flow rate 0.8 ml/min,and detection wavelength 525 nm.Under the chromatographic conditions,the six anthocyanins got good separation effect within 30 min,and the contents showed a good linear relation with the peak area(R＞0.999 3),recovery rate was 82.2%-93.3%and the precision was good(RSD＜5.0%).The method was convenient and fast,which could realize qualitative and quantitative detection of the six anthocyanins in grape and wine.

anthocyanins;HPLC;grape;wine;determination

O657.6

0254-5071（2017）02-0162-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.035

2016-10-24

寧夏回族自治區(qū)自然基金項目（NZ15108）；寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金（NKYJ-15-08）

劉冰（1980-），男，工程師，本科，主要從事林業(yè)產(chǎn)品品種及營養(yǎng)成分研究工作。

*通訊作者：葛謙（1988-），女，碩士研究生，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及風(fēng)險評估工作。