張秀娥 成 蓓 戚本玲 王 倩

蛋白酶激活受體2活化與缺血后處理對(duì)老年糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

張秀娥 成 蓓#戚本玲 王 倩

目的：觀察缺血后處理(IPost)對(duì)老年糖尿病大鼠心肌缺血再灌注(I/R)損傷的影響及蛋白酶激活受體2(PAR-2)活化對(duì)其保護(hù)作用。方法：老年雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)選取45只采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備老年糖尿病大鼠模型，成模大鼠隨機(jī)分成3組(每組15只):I/R組、IPost組、PAR-2作用組(PAR-2組)；未行造模的另15只大鼠作為對(duì)照組(SC組)。SC組開(kāi)胸后不結(jié)扎，曠置150min；I/R組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30min，再灌注120min；IPost組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30min后，再灌注10s，缺血10s，連續(xù)3個(gè)循環(huán)后，再灌注120min；PAR-2組缺血處理前1h尾靜脈注射PAR-2激動(dòng)劑(SLIGRL-NH2)激活PAR-2，其余處理同IPost組。之后下腔靜脈采血，并摘取心臟，分析各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)濃度的差異。結(jié)果：與SC組比較，I/R組心肌梗死面積明顯增加(P<0.01),心肌細(xì)胞凋亡率和MDA濃度升高(P<0.01)，SOD活性下降(P<0.01)；與I/R組比較，IPost組和PAR-2組心肌梗死面積縮小(P<0.05，P<0.01)，心肌細(xì)胞凋亡率和MDA濃度下降(P<0.05，P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05,P<0.01)。PAR-2組較IPost組效果更明顯(P<0.01)。結(jié)論：IPost對(duì)老年糖尿病大鼠心肌I/R損傷有保護(hù)作用，PAR-2活化可進(jìn)一步增強(qiáng)此作用；其機(jī)制可能與其抑制再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷有關(guān)。

蛋白酶激活受體2；缺血后處理；缺血再灌注損傷；老年糖尿病大鼠；心肌保護(hù)

缺血后處理(Ischemic Postconditioning，IPost)可通過(guò)激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減少心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)損傷，這種缺血后干預(yù)方式，已得到許多研究者認(rèn)可[1,2]，但多集中于成年動(dòng)物及單純心肌I/R損傷模型[3]，關(guān)于IPost對(duì)老年糖尿病大鼠心肌I/R損傷是否有保護(hù)作用以及可能機(jī)制，鮮有報(bào)道，尤其對(duì)近年研究發(fā)現(xiàn)的蛋白酶激活受體2(Protease-Activated Receptor 2，PAR-2，可減少心肌梗死面積，發(fā)揮抗心肌I/R損傷[4])與IPost的作用尚未完全清楚。因此，本研究通過(guò)建立老年糖尿病大鼠模型，觀察Ipost對(duì)其心肌I/R的保護(hù)作用及PAR-2活化參與其中的作用效果，為臨床老年I/R損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

H-X小型動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，心電監(jiān)護(hù)儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Image Pro Plus病理圖像分析系統(tǒng)和CIAS-1000細(xì)胞圖像分析儀(北京大恒圖像視覺(jué)有限公司)；細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司，批號(hào)20140306)；TTC、丙二醛(MDA)及過(guò)氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司，批號(hào)20140213、20140117、20140115)；伊文氏藍(lán)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)G6975)；鏈脲佐菌素粉劑(STZ,美國(guó)Sigma公司，批號(hào)S0084，實(shí)驗(yàn)時(shí)用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成1%溶液)，PAR-2激動(dòng)劑SLIGRL-NH2粉劑(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)E5971750001；臨用時(shí)用雙蒸水配制成1mg/ml溶液)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，22-24月齡(相當(dāng)于人類(lèi)60-70歲)，體重350g-520g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。隨機(jī)取45只大鼠，禁食12h后一次性腹腔注射1%STZ(60mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病模型,72h后禁食4h，斷尾取血測(cè)血糖，連續(xù)3天，其血糖濃度≥16.7mmol/L, 且出現(xiàn)多飲、多食、多尿，提示糖尿病模型復(fù)制成功[5]。本次45只大鼠糖尿病模型全部誘導(dǎo)成功。成模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R組)、缺血后處理組( IPost組)和PAR-2活化組(PAR-2組)，各組均15只。未行造模的另15只大鼠平行注射等量生理鹽水，作為對(duì)照組(SC組)。

1.3 各組大鼠處理方法

1.3.1 SC組：以1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后行氣管切開(kāi)術(shù)，連接呼吸機(jī)輔助呼吸，連接心電監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)心電變化，開(kāi)胸，暴露心臟，在左冠狀動(dòng)脈前降支分支下約2mm處穿一結(jié)扎線，但不結(jié)扎，曠置150min。

1.3.2 I/R組：結(jié)扎前處理同SC組。在左冠狀動(dòng)脈前降支分支下約2mm處穿一結(jié)扎線，穩(wěn)定10min后，結(jié)扎左前降支30min造成心肌缺血，心電圖出現(xiàn)ST段升高，放松結(jié)扎線恢復(fù)血流，再灌注120min，至ST段下降50%以上。

1.3.3 IPost組： 同I/R組結(jié)扎左前降支，先缺血30min后，再灌注10s，缺血10s，連續(xù)3個(gè)循環(huán)后，再灌注120min，至ST段下降50%以上。

1.3.4 PAR-2組：缺血處理前1h，尾靜脈注射SLIGRL-NH2(1mg/kg)，之后處理同IPost組。其它三組在實(shí)驗(yàn)前平行注射與本組相同體積生理鹽水。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 心肌梗死面積測(cè)定：再灌注結(jié)束后，重新結(jié)扎左前降支，同時(shí)于尾靜脈注入1%伊文氏藍(lán)2ml，30s后迅速取下心臟，剪掉心房及右心室，左心室藍(lán)染區(qū)為非缺血區(qū)，非藍(lán)染區(qū)為缺血區(qū)。將心臟置于-20℃冰箱30min，取出后切成厚度約為2mm的薄片5-6片，置入37℃ 的0.1%TTC中孵育20min后取出，壞死心肌呈白色，未壞死心肌呈紅色，置入4%甲醛中固定24h，照相后用Image Pro Plus分析系統(tǒng)測(cè)量心肌梗死面積。

1.4.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)： 同上結(jié)扎左前降支后摘取心臟，留取部分左心室，常規(guī)石蠟包埋、切片，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)分析，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞；采用CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，以陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 SOD活性測(cè)定：再灌注末打開(kāi)腹腔，從下腔靜脈抽取靜脈血4ml，以4 500r/min離心5min分離血清，-20℃保存。檢測(cè)前室溫復(fù)融，取血清樣品10μl，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，測(cè)定其550nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算總SOD活性。

1.4.4 MDA濃度檢測(cè)：血液采集及檢測(cè)前處理同1.4.3。取血清樣品0.1ml，采用硫代巴比妥比色法測(cè)定MDA濃度，根據(jù)過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA在酸性條件下加熱與硫代巴比妥酸縮合形成粉紅色化合物，該化合物在532nm處有最大吸收峰，根據(jù)此原理測(cè)定該處吸光度，計(jì)算MDA濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌梗死面積比較

方差分析顯示，各組心肌梗死面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與SC組比較，I/R組心肌梗死面積明顯增加(t=-14.236,P<0.01)；與I/R組比較，IPost組心肌梗死面積縮小(t=2.734，P<0.05)；PAR-2組較IPost組縮小更明顯(t=6.158，P<0.01)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

方差分析顯示，各組心肌細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與SC組比較，I/R組心肌凋亡率明顯升高(t=-8.763,P<0.01)；與I/R組比較，Ipost組下降(t=2.076，P<0.05)；PAR-2組較Ipost組下降更明顯(t=15.721，P<0.01)。見(jiàn)表1、圖2。

2.3 各組血清SOD活性比較

方差分析顯示，各組SOD活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與SC組比較，I/R組SOD活性顯著下降(t=9.108，P<0.01)；與I/R組比較，IPost組SOD活性上升(t=-2.883，P<0.05)；PAR-2組較IPost組升高更明顯(t=-7.153，P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4 各組血清MDA濃度比較

方差分析顯示，各組MDA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與SC組比較，I/R組MDA濃度顯著升高(t=-11.241,P<0.01)；與I/R組比較，IPost組MDA濃度下降(t=2.864，P<0.05)；PAR-2組較IPost組下降更明顯(t=5.612，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組檢測(cè)指標(biāo)比較均=15)

注：與SC組比較，1)P<0.01 ;與I/R組比較，2)P<0.05 ; 與IPost組比較，3)P<0.01

圖1 各組大鼠心肌梗死面積圖 (×200，圖中箭頭所示白色區(qū)域?yàn)閴乃佬募?

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色圖 (×400，圖中箭頭所示棕黃色顆粒為凋亡的心肌細(xì)胞)

3 討 論

糖尿病心血管病變是糖尿病危害最大的一種慢性并發(fā)癥，現(xiàn)實(shí)社會(huì)中，老年人伴發(fā)糖尿病冠心病的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害健康和生命。探討老年糖尿病心肌I/R損傷的病理生理機(jī)制及防治策略已成為老年病學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前的許多研究主要在年輕-成年動(dòng)物/組織模型上進(jìn)行。由于老年人心肌比年輕人心肌更容易受到缺血性傷害，且老化伴隨的心肌改變對(duì)各種應(yīng)激的耐受降低，因而這些結(jié)果并不完全適合老年病臨床應(yīng)用研究；只有針對(duì)老年對(duì)象的研究更能闡述老年患者的臨床機(jī)制。

IPost是近年發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)體內(nèi)源性I/R損傷的保護(hù)機(jī)制，可通過(guò)再灌注前給予的短暫缺血/灌注處理顯著減輕組織的I/R損傷, 是迄今最有希望應(yīng)用于臨床的減輕再灌注損傷的治療手段。研究證實(shí)，IPost在兔、犬、鼠心肌I/R中具有改善I/R心臟的心功能、縮小心肌梗死面積等作用[6，7]。但其對(duì)糖尿病，尤其老年糖尿病心肌I/R損傷是否有保護(hù)作用，尚無(wú)一致結(jié)論或鮮有報(bào)道。本研究給予老年糖尿病大鼠IPost后，其心肌細(xì)胞凋亡率、心肌梗死面積、MDA濃度明顯下降,SOD活性明顯升高，顯著改善了I/R所致心肌凋亡指數(shù)、心肌梗死面積和MDA濃度的升高和SOD活性的下降，證實(shí)IPost 通過(guò)減輕心肌細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞抗氧化力對(duì)老年糖尿病大鼠I/R損傷有保護(hù)作用，與Ma等[8]的研究結(jié)果相符。而Oosterlinck等[9]報(bào)道IPost使糖尿病大鼠對(duì)心肌再灌注損傷的保護(hù)作用減弱，與上述結(jié)果不一致，主要原因可能與動(dòng)物年齡、種屬及IPost方式、糖尿病模型等不同有關(guān)。

PARs屬于G蛋白藕聯(lián)的細(xì)胞表面受體超家族成員，能通過(guò)特殊的蛋白水解機(jī)制活化。PAR-2即胰蛋白酶受體，是該家族成員之一，能夠被胰蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶激活，在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用[10]。SLIGRL-NH2是PAR-2的特異性配體，主要激活PAR-2，通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用[11]。既往只有PAR-2活化減輕心肌氧化損傷，改善冠脈血流，參與缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌I/R損傷保護(hù)作用的報(bào)道[12]，對(duì)心肌IPost這種比心肌缺血預(yù)適應(yīng)更有臨床應(yīng)用前景的心肌保護(hù)機(jī)制以及PAR-2在IPost老年糖尿病大鼠I/R損傷的保護(hù)作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在老年糖尿病大鼠IPost前靜脈給予SLIGRL-NH2，激活PAR-2，結(jié)果顯示，該干預(yù)可較IPost更進(jìn)一步減輕老年糖尿病大鼠I/R引起的氧化損傷和心肌細(xì)胞凋亡，更進(jìn)一步提高SOD活性，降低心肌梗死面積，從而加強(qiáng)IPost對(duì)老年糖尿病大鼠I/R損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，IPost對(duì)老年糖尿病大鼠心肌I/R損傷確有保護(hù)作用，PAR-2活化對(duì)該作用有增強(qiáng)效果；其機(jī)制可能與其抑制再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷有關(guān)，具體信號(hào)通路尚需進(jìn)一步探討。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

張秀娥(1974-)，女，漢族，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣谛牟〉牟±砩頇C(jī)制

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Protective Effect of Protease-Activated Receptor 2 Activation and Ischemic Postconditioning on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Aged Diabetic Rats

ZHANG Xiu-e, CHENG Bei#, QI Ben-ling, WANG Qian

Department of Geriatrics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China；#

Objective: To explore the effect of ischemic postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in aged diabetic rats and the protective effect of protease-activated receptor 2 (PAR-2) activation on myocardial ischemia reperfusion injury.Method: 60 healthy aged (22-24 months) male Wistar rats were obtained. 45 models of aged diabetic rats were induced by using streptozotocin(STZ) and then the diabetic rats were randomly divided into 3 groups (15 animals in each group):ischemia/reperfusion group(I/R group), ischemic postconditioning group(IPost group) and PAR-2 group. In addition, another 15 rats were saline control group(SC group).The rats in SC group were only subjected to opening the chest but blood vessels were not ligated for 120 minutes. The rats in I/R group were induced by left anterior descending coronary artery occlusion for 30 minutes followed by 120 minutes of reperfusin. The rats in IPost group were treated by left anterior descending coronary artery occlusion for 30 minutes at first. Then left anterior descending coronary artery was released for 30 seconds and occluded for 30 seconds.This was repeated for 3 cycles before the coronary artery was reperfused for 120 minutes. The rats in PAR-2 group were subjected to IPost with further intervention. SLIGRL-NH2 was injected to activate PAR-2 before 1 hour. Difference of myocardial apoptosis, myocardial infarct size and levels of superoxide dismutase(SOD) and malonaldehyde(MDA) were analysed in each group.Results: In comparison with SC group, the myocardial infarct size was markedly increased (P<0.01),the myocardial apoptosis index and the serum levels of MDA were increased (P<0.01), but the serum levels of SOD were reduced (P<0.01) in I/R group. Compared with I/R group, the myocardial infarct size was deereased,the myocardial apoptosis index and the serum levels of MDA were decreased while the serum levels of SOD were increased in IPost group (P<0.05) and in PAR-2 group (P<0.01). The effect in PAR-2 group was more remarkable than that of IPost group(P<0.01).Conclusion: Ischemic postconditioning has protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury of aged diabetic rats. The activation of protease-activated receptor 2 can enhance the protective effect. The mechanism may be that myocardial apoptosis and oxidative damage induced by reperfusion were inhibited.

Protease-activated receptor 2; Ischemic postconditioning; Ischemia reperfusion injury; Aged diabetic rats; Cardioprotection

湖北省自然科學(xué)基金(2014CKB1018)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科/老年醫(yī)學(xué)研究所，武漢 430022；#

，E-mail:yuji5832@163.com

本文2016-12-16收到，2017-01-23修回

R541.4

A

1005-1740(2017)01-0001-05