鄒 丹, 周偉強

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室、2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034)

◇論 著◇

乳腺癌MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)HDAC1高功能結(jié)合位點的研究

鄒 丹1, 周偉強2

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室、2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034)

目的 研究乳腺癌MCF-7細(xì)胞中組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1，HDAC1)募集于p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的特異性結(jié)合位點。方法 將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓24 h后，分別用20 μmol·L-10.88 μL SAHA(S 組)、0.625 nmol·L-110 μL Leptin(L組)處理24 h，對照組(B組)細(xì)胞培養(yǎng)在完全型RPMI 1640培養(yǎng)基中。各組細(xì)胞裂解液與HDAC1抗體孵育，收集純化結(jié)合HDAC1抗體的DNA片段，應(yīng)用Real-time PCR法檢測p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)從TSS到其上游(+2～-4 000 bp) f1～f10片段的DNA相對表達量并用2-ΔΔCT法分析。結(jié)果 B組中，HDAC1抗體在p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)f1、f8片段有高親和力，f8片段達最高。S組中，HDAC1抗體與p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)f1～f10片段結(jié)合量明顯低于對照組，f8片段達最低，而在L組此片段與HDAC1抗體結(jié)合量達最大值。結(jié)論 乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖過程中， HDAC1可被招募至p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)， 該啟動子區(qū)上游-2 800 bp至-3 200 bp DNA片段是與HDAC1高度結(jié)合的靶功能區(qū)。

乳腺癌； MCF-7細(xì)胞；p21WAF1/CIP1；組蛋白去乙?；?；辛二酰苯胺異羥肟酸；瘦素

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的蛋白有關(guān)。組蛋白去乙?；?(histone deacetylases 1，HDAC1)使組蛋白去乙?；?，增加組蛋白與DNA雙鏈的親和性，可與一些調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因啟動子區(qū)結(jié)合而抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)是一類可以抑制組蛋白去乙?；富钚?、維持組蛋白乙?；降幕衔?，可促使腫瘤細(xì)胞生長停滯并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。辛二酰苯胺異羥肟酸 (suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)是目前已知最經(jīng)典的HDACi之一, 主要用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療。SAHA可以通過上調(diào)p21WAF1/CIP1引起細(xì)胞周期阻滯于G1期而抑制細(xì)胞增殖[1]。

p21WAF1/CIP1是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，可使細(xì)胞周期停滯、促進細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。乳腺癌p21WAF1/CIP1的表達與細(xì)胞分化程度無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著負(fù)相關(guān)，p21WAF1/CIP1的高表達有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[2]。

瘦素(Leptin)是肥胖基因的表達產(chǎn)物，主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌，包含167個氨基酸，通過與瘦素受體OB-Rb結(jié)合發(fā)揮作用。Leptin血清水平與脂肪儲存量成正比[3]，研究表明：隨著女性體內(nèi)Leptin水平增加，其患高惡性、低分化且預(yù)后不良的乳腺癌幾率大大增加[4]。本研究的前期工作證實Leptin處理后的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞p21WAF1/CIP1 mRNA及蛋白表達水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Leptin未處理組細(xì)胞[5]。

本實驗旨在找出HDAC1募集于p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的具體作用位點，明確SAHA及Leptin在調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子功能過程中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(美國ATCC細(xì)胞庫),SAHA、Leptin(Sigma), 完全型RPMI 1640培養(yǎng)液、改良型RPMI 1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液1X(Thermo), 0.25%胰酶-EDTA(Gibco), PierceTMAgarose ChIP試劑盒(Thermo), HDAC1抗體(Abcam), Power SYBR?Green PCR Master Mix(Life technologies),p21WAF1/CIP1f1～f10引物(上海生工生物工程有限公司), 超凈工作臺、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo), Biofuge 28RS低溫高速離心機(Heraeus), 倒置顯微鏡(Olympus), SK-D1807-E 搖床(Scilogex), 恒溫混勻器(Eppendorf), 7500 Real-Time PCR儀(Life Technologies)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞接種在完全型RPMI 1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素100 kU·L-1)中，37℃、5% CO2孵箱飽和濕度條件下貼壁傳代培養(yǎng)，每2～3天換液并傳代1次。0.25%胰酶-EDTA消化。經(jīng)2～3次傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞等量分成3組，分別接種于完全型RPMI 1640培養(yǎng)液中，24 h后，再將細(xì)胞置于改良型RPMI 1640培養(yǎng)液中進行同步化處理24 h，此后將3組細(xì)胞分別定義為SAHA組(S組，即完全型RPMI 1640培養(yǎng)液10 mL+20 μmol·L-1SAHA 0.88 μL)、Leptin組(L組，即完全型RPMI 1640培養(yǎng)液10 mL+0.625 nmol·L-1Leptin 10 μL)，Basal對照組(B組，即加等量完全型RPMI 1640培養(yǎng)液)。

1.2.2 應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin-immunoprecipitation,ChIP)處理樣品 MCF-7細(xì)胞的甲醛交聯(lián)及細(xì)胞團的分離；細(xì)胞溶解及MNase 消化，每組樣品各得到50 μL的MNase消化產(chǎn)物，留取5 μL -20℃保存作為內(nèi)對照，45 μL進行下一步的免疫沉淀處理，免疫沉淀過程中需向每個ChIP樣品加入HDAC1 抗體10 μg，實驗步驟均按操作手冊完成。最終3組MCF-7細(xì)胞均獲得ChIP得到的DNA及各自的內(nèi)對照。

1.2.3 Real-time PCR檢測各組p21WAF1/CIP1f1～f10片段的DNA相對表達 PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA 1.5 μL，上下游引物各0.75 μL，PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：50℃ 2 min,95℃ 10 min預(yù)變性, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 共40個循環(huán)。每個樣品3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法計算各組DNA 的相對表達量。

p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)的10個片段的引物序列為: f1：Forward 5′-TCC TCC TGG AGA GTG CCA AC-3′，Reverse 5′-TTG GTG CGC TGG ACA CAT TT-3′；f2：Forward 5′-TTC CCG GAA GCA TGT GAC AA-3′，Reverse 5′-GCA CCT GGA GCA CCT AGA CAC C-3′；f3：Forward 5′-CCC GTT TCC CCA GCA GTG TA-3′，Reverse 5′-GCC AGG AAG GGG AGG ATT TG-3′；f4：Forward 5′-AGG CCA AGG GGG TCT GCT AC-3′，Reverse 5′-CGG GGA GGA CAG GCT TCT TT-3′；f5：Forward 5′-TGA AAG CAG AGG GGC TTC AA-3′，Reverse 5′-ACC ATC CAA AGG GCT GGT TG-3′；f6：Forward 5′-TGT CCT TGG GCT GCC TGT TT-3′，Reverse 5′-AGC CCT GTC GCA AGG ATC TG-3′；f7：Forward 5′-TTC TGC AGC CAC CAC TGA GC-3′，Reverse 5′-GTG GAG CAG CAT GGG GTA GG-3′；f8：Forward 5′-CCC ACC TCA GCC ACC TGA AT-3′，Reverse 5′-GGG CAG ATC ACA GGG TCA GG-3′；f9：Forward 5′-AGT GGG CAC ATT TAG ACA TAG CAG GT-3′，Reverse 5′-CCT CCC GGT CAT GCC TTT C-3′；f10：Forward 5′-GTC AGG TGC CAC TGG GGT CT-3′，Reverse 5′-CGG TCC CCT GTT TCA ATG CT-3′。p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)+2～-4 000 bp 10個選定區(qū)域f1～f10(Fig 1)。

Fig 1 Schematic diagram of HDAC1 response element forregulating transcriptional function of p21WAF1/CIP promoter

2 結(jié)果

2.1 B組MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)f1～f10片段HDAC1高功能結(jié)合位點篩選 B組MCF-7細(xì)胞經(jīng)HDAC1抗體Chip處理后，45 μL樣品與5 μL內(nèi)對照的DNA分別與f1～f10引物作用進行Real-time PCR擴增，所得CT值之差為該樣品在p21啟動子區(qū)各自片段的ΔCT值，再以f5片段為對照，其它片段的ΔCT值與其相減，得到B組樣品在p21啟動子區(qū)f1～f10片段各自ΔΔCT值，采用2-ΔΔCT法計算各片段DNA的相對表達量。B組f1、f2、f6、f7、f8片段DNA的相對表達量(1.88±0.18、1.68±0.07、1.35±0.13、1.49±0.09、2.11±0.26)較f5片段相對表達量(1±0)明顯升高(P<0.01)，f8片段達最高值(Fig 2)。

2.2 SAHA作用下MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)f1～f10片段HDAC1高功能結(jié)合位點篩選 S組MCF-7細(xì)胞DNA組分經(jīng)HDAC1抗體ChIP處理后，進行Real-time PCR檢測。結(jié)果表明：S組MCF-7細(xì)胞的p21WAF1/CIP啟動子f1～f10片段 DNA的相對表達量(0.36±0.03、0.23±0.04、0.39±0.13、0.44±0.03、0.27±0.03、0.27±0.02、0.40±0.07、0.19±0.02、0.34±0.02、0.45±0.07)較B組對應(yīng)片段相對表達量(1±0)均明顯降低(P<0.01)，f8片段達最低值(Fig 3)。

2.3 Leptin作用下MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)f1～f10片段HDAC1高功能結(jié)合位點篩選

Fig 2 Screening of high function bind site of HDAC1 among f1～f10 fragments of p21WAF1/CIP promotor region in basal group MCF-7 cells

*P<0.05,**P<0.01vsf5 fragment

Fig 3 Screening of high function bind site of HDAC1 among f1～f10 fragments of p21WAF1/CIP promotor region in MCF-7 cells in SAHA group

**P<0.01vsbasal group

將Leptin處理后的MCF-7細(xì)胞的DNA組分經(jīng)ChIP實驗后進行Real-time PCR檢測。結(jié)果表明：L組細(xì)胞p21WAF1/CIP啟動子區(qū)f1～f10片段結(jié)合HDAC1抗體的DNA相對表達量(5.54±0.17、2.01±0.39、3.59±1.15、5.43±0.48、4.49±0.16、4.14±0.49、4.79±0.66、6.68±0.57、5.02±0.31、5.94±0.45)較B組對應(yīng)片段相對表達量(1±0)均明顯升高(P<0.01)，f8片段達最高值(Fig 4)。

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤之首，其中0.7～0.8的患者為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性[6]，因此選擇ER陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系探索乳腺癌的發(fā)病機制及治療藥物尤為重要。

表觀遺傳改變是基因DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。組蛋白乙?；叭ヒ阴；裙矁r修飾是表觀遺傳學(xué)的主要研究內(nèi)容，現(xiàn)已逐漸成為乳腺癌研究和治療的熱點[7]。在乳腺癌細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞增殖信號在p21WAF1/CIP1的啟動子區(qū)招募HDAC1轉(zhuǎn)錄因子，通過組蛋白去乙酰化表觀遺傳修飾影響p21WAF1/CIP表達。SAHA通過抑制此過程而上調(diào)p21WAF1/CIP1基因的轉(zhuǎn)錄。Leptin通過激活HDAC1的活性使核心組蛋白去乙?；?，從而抑制p21WAF1/CIP1的表達，最終促進細(xì)胞周期從G1期到S期的進程[8]。

Fig 4 Screening of high function bind site of HDAC1 among f1～f10 fragments of p21WAF1/CIPpromotor region in MCF-7 cells in Leptin group

**P<0.01vsbasal group

ChIP可真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息, 是目前基于全基因組水平研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)實驗技術(shù)。本實驗利用這一方法研究發(fā)現(xiàn)： B組 MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP基因轉(zhuǎn)錄起始點近端啟動子調(diào)節(jié)區(qū)f1和遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)f8片段結(jié)合HDAC1抗體的DNA相對表達量較其它區(qū)域明顯升高。這表明在細(xì)胞增殖過程中，HDAC1可被招募至p21WAF1/CIP啟動子區(qū)，促使組蛋白去乙?；?，增強組蛋白與DNA 的親和力，抑制p21WAF1/CIP基因轉(zhuǎn)錄。

SAHA作用下的MCF-7細(xì)胞，與p21WAF1/CIP啟動子區(qū)DNA結(jié)合的HDAC1抗體明顯減少，這表明作用于p21WAF1/CIP啟動子區(qū)的HDAC1明顯減少,且在f8片段(-2 800 bp至-3 200 bp)處受SAHA影響HDAC1與p21WAF1/CIP啟動子區(qū)DNA的結(jié)合量最少。SAHA作為一種廣譜的HDACi，可抑制HDAC1的活性，從而提高組蛋白乙?；某潭?。高乙?；慕M蛋白可提高相關(guān)基因(如p21WAF1/CIP)的轉(zhuǎn)錄水平，最終表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的增殖抑制、分化和凋亡[9]。另有研究報道：SAHA可降低HDAC1的表達而抑制癌組織的生長[10-11]。

Leptin可通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、影響細(xì)胞外環(huán)境等多重機制促進雌激素受體陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[12-14]。本實驗中：Leptin作用下的MCF-7細(xì)胞，與p21WAF1/CIP啟動子區(qū)DNA結(jié)合的HDAC1抗體明顯增多，表明作用于p21WAF1/CIP啟動子區(qū)的HDAC1明顯增多，且在f8片段處受Leptin影響HDAC1與p21WAF1/CIP啟動子區(qū)DNA的結(jié)合量最多。這一實驗現(xiàn)象表明：在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，某些細(xì)胞增殖信號招募HDAC1于p21WAF1/CIP啟動子特定區(qū)域，調(diào)控Leptin對p21WAF1/CIP基因轉(zhuǎn)錄的作用。

綜上所述，本研究通過ChIP技術(shù)篩選出乳腺癌MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)的HDAC1高功能結(jié)合位點，進而通過對SAHA及Leptin處理過的乳腺癌MCF-7細(xì)胞進行ChIP檢測，明確p21WAF1/CIP啟動子區(qū)-2 800 bp至-3 200 bp區(qū)域可能是與HDAC1高度結(jié)合的功能活躍區(qū)。此研究發(fā)現(xiàn)豐富了SAHA和Leptin在調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子功能過程中的分子機制，更為抗乳腺癌的藥物研發(fā)及靶向治療奠定了理論和實驗基礎(chǔ)。

(致謝：衷心感謝沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室為本實驗順利完成提供的實驗設(shè)備，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協(xié)助。)

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A study on high function binding site of HDAC1 in p21WAF1/CIP1promoter region in breast cancer MCF-7 cells

ZOU Dan1, ZHOU Wei-qiang2

(1.DeptofPathophysiology; 2.KeyLaboratoryofEnvironmentalPollutionandMicroecologyofLiaoningProvince,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Aim To investigate the specific binding sites that HDAC1 can be recruited to regulate the transcriptional activity of p21WAF1/CIP1promoter in the breast cancer MCF-7 cells.Methods The breast cancer MCF-7 cells in logarithmic growth phase were starved with FBS free medium for 24 hours, and treated with 20 μmol·L-1SAHA(S group) or 0.625 nmol·L-1Leptin(L group) for 24 hours, and the cells that were cultured in the complete RPMI 1640 medium without any treatment were assigned as control group(B group). The DNA-ChIP was followed the manufacturer′s protocol for the assay. The cell lysis was prepared and incubated with anti-HDAC1 antibody overnight at 4℃. DNA fragments binding anti-HDAC1 antibody were gathered and purified. The relative expression level of DNA fragments from TSS to the upstream of the p21WAF1/CIP1promoter region(+2～-4 000 bp) binding with antibody was detected by Real-time PCR and analyzed by 2-ΔΔCTmethod.Results In B group, HDAC1 had high affinity with the f1 and f 8 fragments of p21WAF1/CIP1promoter compared to the other fragemts, and showed the highest affinity with the f8 fragment. In S group, the binding ability of HDAC1 to the f1～f10 fragment of p21WAF1/CIP1promoter was significantly lower than that of the control. The binding activity of HDAC1 to f8 fragment was the lowest, while reversing to reach the peak after leptin treatment.Conclusions HDAC1 can be recruited to p21WAF1/CIP1promoter by the cell proliferation signal during the proliferation of breast cancer MCF-7 cells. The DNA fragment from -2 800 to -3 200 bp in the upstream of p21WAF1/CIP1promoter is the target functional region for the binding with HDAC1.

breast cancer;MCF-7 cell;p21WAF1/CIP1;HDAC1;suberoylanilide hydroxamic acid;leptin

時間：2017-3-4 11:49

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1149.012.html

2016-09-18,

2016-12-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81172509)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(No 201602735)；沈陽市科技計劃項目(No F15-199-1-28)

鄒 丹(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：腫瘤調(diào)控，E-mail:3394984343@qq.com; 周偉強(1970-)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤調(diào)控，通訊作者,E-mail: zhouwq@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.006

A

1001-1978(2017)03-0317-05

R329.24；R392.11；R737.9；R977.1；R977.3