周世娟

[摘要]目的 探討如何鑒定陽性血培養(yǎng)瓶里“失蹤”的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）。方法 采用靶向DNA測序（16S rRNA基因擴(kuò)增）的方法最后鑒定出“失蹤”的細(xì)菌。結(jié)果 “失蹤”的細(xì)菌被鑒定為肺炎鏈球菌。結(jié)論 依據(jù)靶向DNA測序（16S rRNA基因擴(kuò)增）鑒定可及時、準(zhǔn)確鑒定出因自溶死亡的肺炎鏈球菌，啟示微生物檢驗(yàn)程序中血培養(yǎng)報(bào)陽后應(yīng)立即涂片、轉(zhuǎn)種平板，并結(jié)合血培養(yǎng)生長曲線、涂片染色結(jié)果作進(jìn)一步的分析等，以提高血培養(yǎng)的陽性檢出率，有利于減少漏報(bào)及誤報(bào)的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]16S rRNA；測序；肺炎鏈球菌；自溶

[中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0126-03

[Abstract] Objective To explore how to identify the disappeared Streptococcus pneumoniae in positive blood culture flask.Methods By targeted DNA sequencing （16S rRNA gene amplification），the disappeared bacterium was finally identified.Results The disappeared bacterium was identified as Streptococcus pneumoniae.Conclusion By targeted DNA sequencing （16S rRNA gene amplification） identification can detect the Streptococcus pneumoniae dead due to autolysis.It is indicated that in the process of bacteriological examination，smear and transmission to plate combined with growth curve and smear results of blood culture are performed right away after blood culture being positive.Together with growth curve of blood culture and outcomes of smear staining，further analysis is needed in order to increase positive detection rate of blood culture and reduce occurrence of report in fail and mistake.

[Key words]16S rRNA；Sequencing；Streptococcus pneumoniae；Autolysis

血流感染（blood stream infection，BSI）是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，包括菌血癥和敗血癥，是致病菌或條件致病菌侵入血液中生長繁殖并釋放毒素和代謝產(chǎn)物而引起的急性重癥感染性疾病，其發(fā)病率和致死率都較高[1]。全球每年約發(fā)生200 000例BSI，病死率為20%～50%，是最嚴(yán)重的感染性疾病之一[2]。美國每年約有750 000例患者患血源性感染，導(dǎo)致215 000例死亡，是美國第十大死因，占總死亡人數(shù)的6%[3-4]。在兒童患者中，革蘭陽性菌引起的BSI病毒死率達(dá)19.2%，革蘭陰性菌引起的BSI病死率為45.2%，真菌菌血癥則為35.8%。在醫(yī)院感染中，BSI占15%，不僅延長了患者的住院時間，還增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

血培養(yǎng)是臨床判斷患者BSI的最重要依據(jù)[1]。所以實(shí)驗(yàn)室對陽性血培養(yǎng)瓶分離鑒定出病原菌，對臨床感染性疾病的診斷起了決定性的作用。目前血培養(yǎng)病原菌的鑒定主要依賴轉(zhuǎn)種分離得到純菌后，才可進(jìn)一步做細(xì)菌的鑒定。對于一些苛養(yǎng)菌、固體培養(yǎng)基不生長細(xì)菌的鑒定就比較困難，提高警惕，以防漏報(bào)、誤報(bào)。現(xiàn)將本室在血培養(yǎng)檢測工作中的1例陽性血培養(yǎng)瓶中細(xì)菌的神秘“失蹤”后的輾轉(zhuǎn)鑒定過程報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2016年4月，患者男，65歲，腫瘤科新入院肺癌患者，不規(guī)則發(fā)熱1周余，偶有咳嗽、喘憋、呼吸增快、呼吸困難等，入院查體，體溫38.3℃，血常規(guī)：WBC 20.46×109/L，中性粒細(xì)胞百分比96.7%，C-反應(yīng)蛋白58.96 mg/L，降鈣素原9.66 mg/ml，抽取單瓶血需氧培養(yǎng)送微生物室做檢查（本微生物室尚未開展厭氧培養(yǎng)）。

1.2檢測用儀器、試劑

儀器：Versa TREK-96全自動血培養(yǎng)儀（美國TREK公司）；Olympus CX21顯微鏡（奧林巴斯公司）；CO2培養(yǎng)箱WJ-Ⅲ-50B型（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；普通培養(yǎng)箱WS2-134-65型（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；3730XL測序儀（ABI公司）等。

試劑：血平板（廣州迪景微生物科技有限公司）、巧克力平板、麥康凱平板（法國梅里埃）等；快速革蘭染液、抗酸染液（珠海貝索公司）、瑞氏染液（杭州天和微生物試劑有限公司）；需氧血培養(yǎng)瓶（美國TREK公司配套）；肺炎鏈球菌抗原檢測試劑（美國Binax NOW公司）。

1.3質(zhì)量控制

革蘭染色采用省臨檢中心提供的質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株分別做陽性、陰性質(zhì)控對照，其他項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控都在控。

1.4接收標(biāo)本后鑒定流程

簡易流程見圖1。

第1天：標(biāo)本采集與培養(yǎng)方法參照《血培養(yǎng)檢測規(guī)范化操作》[5]進(jìn)行標(biāo)本的正確采集并將其快速置于全自動血培養(yǎng)儀中進(jìn)行連續(xù)振蕩培養(yǎng)和監(jiān)測，未見陽性報(bào)警。

第2天：早上8：00上班時將陽性報(bào)警瓶（曲線典型）卸出，見瓶內(nèi)上清呈輕微混濁，后無菌操作抽取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板（35℃，5%CO2孵箱）、麥康凱平板（35℃孵箱），陽性瓶內(nèi)容物涂片同時進(jìn)行革蘭染色鏡檢為革蘭陰性成對排列球菌（圖2）。

第3天：轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的血平板、巧克力平板、麥康凱平板均無菌生長；重新將報(bào)警陽性瓶內(nèi)容物涂片進(jìn)行革蘭染色、抗酸染色、瑞氏染色后均無菌，前1 d涂片看見的G-成雙排列球菌卻神秘“失蹤”了，重抽取陽性報(bào)警瓶（瓶內(nèi)上清變澄清）中原始培養(yǎng)物注入新的血培養(yǎng)瓶（傳代培養(yǎng)瓶）上全自動血培養(yǎng)儀繼續(xù)監(jiān)測培養(yǎng)，再將原陽性報(bào)警瓶重新轉(zhuǎn)種培養(yǎng)至血平板、巧克力平板、麥康凱平板。原陽性培養(yǎng)液瓶上清澄清，僅見管底留有少許米黃色沉淀。另取出肺炎鏈球菌抗原檢測板，抽取陽性報(bào)警瓶中原始培養(yǎng)物2 ml，離心取上清，用配套的Binax棉簽蘸取上清標(biāo)本加入到試劑?？變?nèi)，往孔內(nèi)滴入3滴試劑A，靜止15 min后讀取結(jié)果為陽性?！笆й櫋本蔀榉窝祖溓蚓颉白匀堋倍劳鱿Ц怕蚀?，遂立即將原陽性血培養(yǎng)瓶上送廣州金域檢驗(yàn)中心進(jìn)行靶向DNA測序鑒定。

第4天后：傳代培養(yǎng)瓶監(jiān)測培養(yǎng)期間未見陽性報(bào)警，卸下瓶內(nèi)澄清，未見沉淀，涂片鏡檢未見細(xì)菌；重新轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的血平板、巧克力平板、麥康凱平板仍無菌生長。

2結(jié)果

該原陽性血培養(yǎng)瓶第2天涂片“曇花一現(xiàn)”見“影”——G-成對排列球菌后，第3天后就“無影無蹤”，遂加做陽性報(bào)警瓶中原始培養(yǎng)物肺鏈抗原檢測為陽性（目標(biāo)鎖定為肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌）[6]，并將有少許米黃色沉淀的原陽性報(bào)警瓶上送廣州金域檢驗(yàn)中心做基因測序，有效序列經(jīng)分析顯示與肺炎鏈球菌的相似度為100%。由此真相大白：陽性血培養(yǎng)瓶“失蹤”菌為肺炎鏈球菌，因“自溶”使菌體從“有影”到“無蹤”。

回顧性檢查全自動血培養(yǎng)儀中該陽性血培養(yǎng)瓶的初報(bào)陽時間為接收標(biāo)本次日凌晨1：30報(bào)警，但因條件所限（本室晚上無夜班輪崗）沒及時轉(zhuǎn)種，次日8：00（距離初報(bào)陽>6.5 h）上班同事才處理陽性血培養(yǎng)瓶，涂片可見G-成對排列球菌，而第3天轉(zhuǎn)種未見細(xì)菌生長及原陽瓶重涂片細(xì)菌卻“失蹤”了，傳代培養(yǎng)瓶進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測培養(yǎng)，未見陽性報(bào)警，種種跡象符合蔡婷婷等[7]的報(bào)道結(jié)果：肺炎鏈球菌陽性報(bào)警后6 h為革蘭陰性球桿菌，在陽性報(bào)警后可在8～10 h內(nèi)自溶死亡。我室在陽性報(bào)警6.5 h后方進(jìn)行轉(zhuǎn)種、涂片染色等處理，錯過最佳處理時間。

3討論

1881年肺炎鏈球菌首次由巴斯德（Louis Pasteur）及G.M.Sternberg分別在法國及美國從患者痰液中分離出。肺炎鏈球菌常定植于人體呼吸道，尤以鼻咽部最常見，羅小銘等[8]報(bào)道中山地區(qū)正常人群鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶率為26.6%，少年兒童鼻咽部攜帶率較成人高。由此可見呼吸道黏膜對肺炎鏈球菌存在很強(qiáng)的自然抵抗力。隨著各種血液留置導(dǎo)管的介入，臨床抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和大量免疫受損宿主的出現(xiàn)，各種原因使機(jī)體抵抗力下降時易發(fā)生侵襲性肺炎鏈球菌疾病，包括菌血癥、敗血癥、腦膜炎、膿胸、骨髓炎等[9]。在化膿性球菌中，肺炎鏈球菌的致病力僅次于金黃色葡萄球菌。劉德華等[1]報(bào)道從2013～2014年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)云南地區(qū)28家三級醫(yī)院的14 519株血培養(yǎng)陽性菌株中肺炎鏈球菌110株，構(gòu)成比占0.76%。本病例為肺癌患者，機(jī)體抵抗力低下，易受侵襲。

肺炎鏈球菌屬鏈球菌科，鏈球菌屬。肺炎鏈球菌是革蘭陽性菌，肺炎鏈球菌菌體為革蘭陽性，呈矛頭狀，多成雙排列（故亦稱為肺炎雙球菌），寬端相對，尖端相背，有較厚莢膜（有毒株在體內(nèi)形成莢膜：普通染色時莢膜不著色，表現(xiàn)為菌體周圍透明環(huán)），無鞭毛，不形成芽胞。當(dāng)菌體衰老時，或由于自溶酶的產(chǎn)生將細(xì)菌裂解后，可呈現(xiàn)革蘭染色陰性[2]。本菌為苛養(yǎng)菌，營養(yǎng)要求較高，需在含血液或血清的培養(yǎng)基中生長。在固體培養(yǎng)基上形成小圓形、隆起、表面光滑、濕潤的草綠色菌落。培養(yǎng)初期菌落隆起呈穹隆形，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)菌產(chǎn)生的自溶酶裂解細(xì)菌，使菌落中央凹陷，邊緣隆起呈“臍窩狀”或火山口狀。在血清肉湯中培養(yǎng)稍久亦因細(xì)菌自溶而使混濁的培養(yǎng)液漸變澄清[10]。

肺炎鏈球菌本身存在自溶的特性，主要原因是其自溶素（細(xì)胞壁水解酶，autolysin of S.pn，LytA）通過裂解-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸，導(dǎo)致細(xì)胞壁肽聚糖骨架斷裂，使細(xì)胞壁坍塌，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡[11]，過程中會引起菌體革蘭染色特性的改變（G+→G-），見圖2。肺炎鏈球菌當(dāng)生長進(jìn)入穩(wěn)定期后會立即引起溶菌[12]，表現(xiàn)在培養(yǎng)24 h左右使血平板菌落中心塌陷呈臍窩狀，在液體培養(yǎng)基隨著培養(yǎng)時間的延長溶解死亡而使培養(yǎng)基澄清，僅見管底留有少許沉淀。蔡婷婷等[7]研究肺炎鏈球菌在陽性血培養(yǎng)瓶報(bào)警后6 h革蘭染色鏡檢為G-球桿，并在8～10 h內(nèi)自溶死亡。所以及時轉(zhuǎn)種陽性血培養(yǎng)瓶是減少肺炎鏈球菌漏檢的關(guān)鍵。

以前，肺炎鏈球菌的鑒定只能依賴對分離的活菌采用傳統(tǒng)方法：菌落形態(tài)（自溶現(xiàn)象、臍窩狀菌落、寬大草綠色溶血環(huán)）、革蘭染色特征（G+，菌體呈矛頭狀，多呈雙排列，寬端相對，尖端相背，有較厚莢膜）及奧普托欣敏感試驗(yàn)、菊糖陽性試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和膽鹽溶菌試驗(yàn)等[13-14]進(jìn)行鑒定。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，鑒定此菌檢驗(yàn)方法也日新月異，如自動化細(xì)菌鑒定儀、肺炎鏈球菌抗原試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、分子生物學(xué)檢測（質(zhì)譜技術(shù)及基因測序）等。本菌當(dāng)面臨轉(zhuǎn)種后無活菌生長時，用傳統(tǒng)方法鑒定已不可能，只能選擇免疫分析及遺傳學(xué)方法補(bǔ)救鑒定。Petti等[6]對于陽性血培養(yǎng)瓶中的疑似肺炎鏈球菌標(biāo)本，選用免疫層析試條檢測肺炎鏈球菌抗原發(fā)現(xiàn)緩癥鏈球菌與肺炎鏈球菌有交叉反應(yīng)，特異性不夠強(qiáng)。因此，最后選擇遺傳學(xué)——分子生物學(xué)的診斷方法[2]，如靶向DNA測序（16S rRNA基因擴(kuò)增）鑒定。細(xì)菌16S rRNA的相對分子量大小適中，約1500 bp，適合序列分析，又因其含有對所有細(xì)菌種及可變區(qū)的廣泛區(qū)段[15]。因此16S rRNA基因成為細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定的理想靶序列，也廣泛被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受和使用。在DNA序列分析中，16S rRNA最常用于鑒定細(xì)菌的種，鑒定快速、簡便、特異性好，是目前對在臨床苛養(yǎng)菌以及固體培養(yǎng)基不生長細(xì)菌進(jìn)行鑒定、檢測和新菌種發(fā)現(xiàn)方面最可靠的方法之一[2]。

綜上所述，血培養(yǎng)是當(dāng)前BSI病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過對本院1例血培養(yǎng)中肺炎鏈球菌自溶現(xiàn)象的闡述，啟示在微生物檢驗(yàn)過程序中時常會出現(xiàn)一些假陽性及假陰性結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立一個有效的減少漏報(bào)及誤報(bào)情況的機(jī)制，如建議臨床雙瓶送檢培養(yǎng)；建立微生物室預(yù)警機(jī)制，報(bào)警后立即涂片、轉(zhuǎn)種平板，并結(jié)合血培養(yǎng)生長曲線、涂片染色結(jié)果行進(jìn)一步的分析等，有利于防止如本案例肺炎鏈球菌假陰性培養(yǎng)的發(fā)生，提高血培養(yǎng)的陽性檢出率，減少漏報(bào)及誤報(bào)的發(fā)生。

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（收稿日期：2016-11-20 本文編輯：方菊花）