安 琳,蘇慎勇? ,楊衛(wèi)東,張 祎,許 敏, 李海飛, 李 磊, 朱紅偉,王素娟,湯若琪

1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(保定071000), 2.河北省保定市第二醫(yī)院放射科(保定 071000),3.河北醫(yī)科大學(xué)(石家莊 050017)

△通訊作者

熱療聯(lián)合5-氟尿嘧啶對胃癌MKN45細(xì)胞抑制作用機制研究

安 琳1,蘇慎勇1?,楊衛(wèi)東2,張 祎2,許 敏2, 李海飛2, 李 磊2, 朱紅偉2,王素娟2,湯若琪3

1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(保定071000), 2.河北省保定市第二醫(yī)院放射科(保定 071000),3.河北醫(yī)科大學(xué)(石家莊 050017)

目的：探討5-氟尿嘧啶(5-Fu)溫?zé)峄煂θ说头只赴┘?xì)胞(MKN45細(xì)胞)抑制的分子作用機制。方法：以MTT法測定MKN45細(xì)胞48h的IC50作為實驗工作濃度，實驗分對照組(C)、熱療組(H)、化療組(D)、熱化療組(HD)，檢測細(xì)胞抑制率；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察表皮生長因子受體EGFR與原癌基因RAS mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：熱、化療均可抑制MKN45細(xì)胞系 (P<0.05)，熱化療抑制作用更明顯(P<0.05)；RT-PCR分析顯示，熱化療組EGFRmRNA與RASmRNA表達(dá)下調(diào)最明顯(P<0.05)。EGFR mRNA與RAS mRNA的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)性(r=0.870，P<0.05)，細(xì)胞抑制率與EGFRmRNA表達(dá)水平間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.956，P<0.05)，細(xì)胞抑制率與RASmRNA表達(dá)水平間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.923，P<0.05)。結(jié)論：化療聯(lián)合熱療能顯著增加對MKN45細(xì)胞的體外抑制作用，其機制可能與下調(diào)EGFR與RAS的表達(dá)及二者相互作用有關(guān)。

胃癌是我國最多見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，由于胃癌早期臨床癥狀缺乏特異性，因而確診時往往多屬于中晚期。5-Fu是抑制腫瘤細(xì)胞S期的特異性藥物,轉(zhuǎn)化成的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，抑制DNA合成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡和周期停滯。研究顯示,EGFR4 抑制劑PD173074與5-Fu聯(lián)用可阻滯細(xì)胞周期，抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡[1]。通過恒溫?zé)崴〖訜崮[瘤組織，殺滅癌細(xì)胞的方法近些年有了新的進(jìn)展[2-3]。因此兩種方法聯(lián)合應(yīng)用可以發(fā)揮協(xié)同作用，以提高病人的生存率和延長無進(jìn)展生存期[4]。

材料和方法

1 藥品與試劑 鹽酸5-氟尿嘧啶；RPMI 1640；四氮甲唑藍(lán)(MTT)； RT-PCR試劑盒；引物。

2 細(xì)胞及其培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株(MKN45)。將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃恒溫，5%CO2飽和濕度環(huán)境中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

3 5-氟尿嘧啶實驗濃度的確定 (根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)實驗結(jié)果)將5-氟尿嘧啶分為50、100、200 mg/ml 三個不同濃度組，計算IC50值作為實驗濃度。

4 細(xì)胞的分組與處理 37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)對照組(C組)細(xì)胞；化療組(D組)加IC50值的5-Fu；熱療組(H組)將培養(yǎng)瓶浸沒于43℃水中 (波動幅度≤±0.2℃)加熱時間為60 min繼續(xù)培養(yǎng)；溫?zé)峄熃M(HD組)同上。

5 MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率確定工作濃度對數(shù)生長期的MKN45細(xì)胞，以5×104個/ml密度接種于每孔180 ml的96孔培養(yǎng)板。24 h后按實驗分組加藥和(或)加溫，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后加MTT，加二甲基亞砜(DMSO) 150 ml，每組設(shè)3個復(fù)孔，全自動酶標(biāo)儀測吸光度(OD值)，細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值×100%。

6 RT-PCR檢測上述各組MKN45細(xì)胞EGFR、RAS的mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA, 紫外分光光度計檢測濃度。EGFR 18上游引物5′-CCATGTCTGGCACTGCTTTC-3′下游引物5′-TACAGCTTGCAAGGACTCTGG-3′，擴增產(chǎn)物215bp；K-RAS上游引物5′-AAAGGTACGGTGGAGTATTTGATAGTG-3′下游引物5′-TCATGAAAATGGTCAGAGAAACCT-3′擴增產(chǎn)物169bp；β-actin上游引物5′-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′下游引物5 ′-ACTCATCGTACGCCTGCTTGCTGA-3′擴增產(chǎn)物480 bp；由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 ml，包含cDNA2 ml；上、下游引物各2.5 ml；綠色體系(含TaqDNA聚合酶、MgCl2等)12.5 ml；DEPC水5.5 ml。循環(huán)參數(shù)為：①EGFR：95℃ 預(yù)變性30 s，65℃變性30 s，72℃退火45 s，72℃延伸7 min，33個循環(huán)后 72℃延伸5 min終止反應(yīng)。②RAS：95℃預(yù)變性30 s，55℃變性30 s，72℃退火30 s，72℃延伸7 min，33次循環(huán)后終止反應(yīng)。③β-actin：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35次循環(huán)后，72℃延伸7 min終止反應(yīng)。目的基因和β-actin各6μl，EB染色，于1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外透射儀觀察并照相，輸入微機應(yīng)用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)分析軟件對目的電泳條帶進(jìn)行分析，擴增產(chǎn)物的光密度值(D)，結(jié)果以兩者光密度的比值表示。mRNA表達(dá)相對值=目的片段光密度值/β-actin光密度值。以表達(dá)強度≥0.10的值定為陽性表達(dá)。實驗重復(fù)3次[4-5]。

結(jié) 果

1 確定5-氟尿嘧啶實驗濃度及MKN45細(xì)胞增殖抑制率 5-氟尿嘧啶對MKN45細(xì)胞的抑制作用存在時間、濃度依賴性。200μg/ml為5-氟尿嘧啶的48 h IC50值，見表1、2。

2 RT-PCR半定量檢測細(xì)胞內(nèi)EGFR mRNA、RAS mRNA水平表達(dá)變化 RT-PCR分析熱化療組細(xì)胞的EGFR、RAS的表達(dá)降低最顯著 (P<0.05)，見表3。

表1 5-氟尿嘧啶對MKN45細(xì)胞增殖抑制的作用

注：▲ IC值大于50%

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率

注：HD組與C、D、H組比較，P<0.05

表3 各組EGFR、RAS mRNA表達(dá)

注：HD組與C組、D組、H組比較，P<0.05

討 論

熱療對腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，并可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。胡萍萍等[6]報道,瘤體注射鴉膽子乳劑加5-氟尿嘧啶聯(lián)合中藥治療胃腫瘤可收到較好療效。有研究表明，熱療聯(lián)合5氟尿嘧啶通過下調(diào)BCL-2和上調(diào)Hsp70促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡和增強耐熱性，二者有協(xié)同作用增強化療敏感性[7]。

RAS在傳遞細(xì)胞生長分化信號方面起重要作用。作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因。Ras下游通路 Ras/Raf通路Rho/Rac通路可從以下幾方面阻斷Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：①酪氨酸蛋白激酶抑制劑，廣泛抑制ErbB22或(和)EGFR過表達(dá)的腫瘤生長；②抑制Ras法尼基化；③反義核苷酸技術(shù)：Harish Chandra Pal和Zhang G實驗結(jié)果表明靶向EGFR/VEGFR2通路，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，抑制增殖[8-9]。Ouyang L發(fā)現(xiàn)植物血凝素靶向作用于人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞EGFR介導(dǎo)的Ras-Raf-MEK-ERK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，因此可以作為一種新型抗腫瘤藥物[10]。Han SY用通光藤提取物(5、10、20 g/kg)分別作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞異種移植的裸鼠模型，抑制EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其減少瘤重和促進(jìn)凋亡作用呈劑量依賴性。20 g/kg是最有效劑量，聯(lián)合吉非替尼可有效治療非小細(xì)胞肺癌[11]。Thang ND實驗用100 nM紫杉醇治療威羅菲尼耐藥的SKMEL-28黑色素瘤細(xì)胞，在SKMEL-28R 細(xì)胞株中pAKTs的磷酸化水平升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，RAS和 pAKTs表達(dá)降低，降低細(xì)胞增殖、侵襲和克隆。在A375PR, A375MR 和 SKMEL-28R突變的三種細(xì)胞株中降低，證實降低MEK 和 ERK水平的磷酸化，在RAS/RAF/MEK/ERK信號通路中起關(guān)鍵作用。結(jié)果證實依賴于BRAFV600E突變，對威羅替尼耐藥細(xì)胞株SKMEL-28R，紫杉醇與威羅替尼可聯(lián)合應(yīng)用提高效率[12]。實驗表明阻斷陰莖癌細(xì)胞中EGFR-RAS通路，降低EGFR過表達(dá)，應(yīng)用EGFR抑制劑成為治療新策略[13]。Okada 等[14]通過抑制EGFR介導(dǎo)的信號通路RAS/RAF/MEK和 PI3K/AKT ，抗EGFR抗體西妥昔單抗抑制直腸癌細(xì)胞生長，侵襲，轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果表明，熱化療組MKN45細(xì)胞處理48h后MTT和RT-PCR進(jìn)行檢測細(xì)胞抑制率、EGFR mRNA和K-RAS mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱化療后EGFR和RAS的mRNA表達(dá)降低顯著。表皮生長因子受體抑制劑(EGFR)表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，而在一些腫瘤細(xì)胞中常過表達(dá)，EGFR的過表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差有關(guān)。EGFR下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：一條是Ras/ Raf/ MEK/ERK-MAPK 通路，而另一條是PI3K/Akt/mTOR通路。 Ras蛋白為膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，相對分子質(zhì)量為2.1萬，Ras(P21)蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，它在傳遞細(xì)胞生長分化信號方面起重要作用。作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因。由此可提示通過下調(diào)EGFR和RAS表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞生長, EGFR有可能通過RAS因子水平的調(diào)節(jié)起作用。熱療和5-氟尿嘧啶聯(lián)用明顯抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述, 熱療聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療能通過抑制細(xì)胞生長使5-氟尿嘧啶應(yīng)用提高效率，可以推測熱療聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療為腫瘤治療提供廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Ye YW, Hu S, Shi YQ.Combination of the FGFR4 inhibitor PD173074 and 5-fluorouracil reduces proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer[J]. Oncol Rep，2013，30(6):2777-2784.

[2] Saitoh Y, Yoshimoto T, Kato S.Synergic carcinostatic effects of ascorbic acid and hyperthermia on Ehrlich ascites tumor cell[J].Exp Oncol，2015，37(2):94-9.

[3] Kim YS, Lee TH, O'Neill BE.Non-lethal heat treatment of cells results in reduction of tumor initiation and metastatic potential[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，464(1):51-6.

[4] Liu T, Ye YW, Zhu AL. Hyperthermia combined with 5-fluorouracil promoted apoptosis and enhanced thermotolerance in human gastric cancer cell line.SGC-7901[J].Onco Targets Ther， 2015 ，27(8):1265-70.

[5] 張 祎，楊衛(wèi)東，于惠玲.熱療聯(lián)合5氟尿嘧啶影響胃癌MKN45細(xì)胞的體外抑制、凋亡的研究[J].中國綜合臨床,2015 , 31(1):391.

[6] 胡萍萍，金春暉，俞惠新，等.中西藥局部注射聯(lián)合灌服開道散對人胃癌裸鼠移植瘤的實驗研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30(9)：1258-1259.

[7] 魏素菊，張 祎.熱療聯(lián)合表柔比星影響胃癌MGC803細(xì)胞的體外抑制、凋亡的研究[J].中國老年學(xué),2011,31(13):2524-2526.

[8] Harish CP, Samriti S. Leah ray strickland delphinidin reduces cell proliferation and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells by targeting EGFR/VEGFR2 signaling pathways [J].Plos One,2013,8(10) :108-110.

[9] Zhang G, Ye X, Ji D.Inhibition of lung tumor growth by targeting EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB pathways with novel theanine derivatives[J]. Oncotarget, 2014 ,5(18):8528-43.

[10] Ouyang L , Chen Y , Wang XY.Polygonatum odoratum lectin induces apoptosisand autophagy via targeting EGFR-mediated Ras-Raf-MEK-ERK pathway in human MCF-7 breast cancer cells[J]. Phytomedicine, 2014,21 (12): 1658-65.

[11] Han SY , Zhao W , Sun H. Marsdenia tenacissima extract enhances gefitinib efficacy in non-small cell lung cancer xenografts[J].Phytomedicine, 2015 ,22 (5): 560-7.

[12] Thang ND,Nghia PT,Kumasaka MY.Treatment of vemurafenib-resistant SKMEL-28 melanoma cells with paclitaxel[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015 ,16 (2): 699-705.

[13] Gou HF, Li X,Qin M.Epidermal growth factor receptor (EGFR)-RAS signaling pathway in penile squamous cell carcinoma [J].PLoS One,2013,8(4): e62175.

[14] Okada Y, Miyamoto H, Goji T.Biomarkers for predicting the efficacy of anti-epidermal growth factor receptor antibody in the treatment of colorectal cancer[J]. 2014,89(1):18-23.

(收稿：2016-06-02)

The inhibitive effect of gastric carcinoma cell line MKN45 with hyperthermia and 5-Fu in vitro An Ling,Su Shenyong,Yang Weidong,et al.

Medical Oncology, Second Hospital of Hebei Baoding(Baoding 071000)

Objective: To observe the inhibitive effect of MKN45 cells with 5-Fu and hyperthermia,and discusses its mechanism. Methods: MTT assay determine the inhibiting concentration 50%(IC50)at 48 hours as its working concentration.The cells were divided into control、chemotherapy、hyperthermia and hyperthermia combined with chemotherapy groups.The EGFR mRNA and RAS mRNA were determined by RT-PCR . Results: 5-Futhermo-chemotherapy showed the most obvious inhibition to MKN45 cells(P<0.05). A positive response correlation could be found between the expression of EGFR mRNA and RAS mRNA(r=0.870). There was negative response correlation between the inhibitive effect and the expression of EGFR mRNA (r=-0.956，n=12) .There was negative response correlation between the inhibitive effect and the expression of RAS mRNA(r=-0.923，n=12).Conclusion: 5-Furubicin combined with hypothermia shows obvious inhibitive effect to MKN45 cells ，increases the inhibition,possibly through down-regulation of EGFR and RAS .

Stomach neoplasms/physiopathology Fluorouracil/drug effects Diathermy Apoptosis Releptor,epidermal growth factor

胃腫瘤/病理生理學(xué) 氟尿嘧啶/藥物作用 透熱療法 細(xì)胞凋亡 受體，表皮生長因子

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.007