郭曉波,姚 靜,楊 樂(lè)△,藺 京,

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

慢性粒細(xì)胞白血病BCR-ABL融合基因檢測(cè)及其臨床意義*

郭曉波1,姚 靜2,楊 樂(lè)1△,藺 京1,

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

目的：探討B(tài)CR-ABL融合基因與慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的相關(guān)性。方法：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)168例CML患者體內(nèi)BCR-ABL含量，并與113例非CML患者作為對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，分析BCR-ABL基因與CML的相關(guān)性。結(jié)果：168例CML患者BCR-ABL檢測(cè)陽(yáng)性156例(92.9%)，陰性12例(7.1%)。對(duì)照組113例非MCL者BCR-ABL陽(yáng)性3例(2.7%)，BCR-ABL陰性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，BCR-ABL陽(yáng)性組男性高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽(yáng)性組的平均年齡和白細(xì)胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：BCR-ABL是診斷CML重要輔助檢查，與CML之間存在相關(guān)性。

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一種造血干細(xì)胞惡性疾病，患者外周血白細(xì)胞數(shù)多明顯增加，重度貧血或血小板數(shù)持續(xù)增高或持續(xù)下降。其分子生物學(xué)特征是通過(guò)FISH、RT-PCR術(shù)或Southern blot方法可以檢測(cè)出BCR-ABL融合基因突變，該基因編碼的融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，從而引發(fā)大量異常細(xì)胞的惡性增殖[1-2]。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病[3]。BCR-ABL融合基因的表達(dá)水平反應(yīng)了患者體內(nèi)白血病細(xì)胞的負(fù)荷量，精確檢測(cè)BCR-ABL融合基因表達(dá)水平，對(duì)白血病的臨床分型診斷、個(gè)體化治療方案的制定、治療效果檢測(cè)、緩解后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的估計(jì)和預(yù)防、干細(xì)胞移植后殘留細(xì)胞的檢測(cè)和早期干預(yù)治療等方面具有重要作用。本文對(duì)CML患者進(jìn)行BCR-ABL融合基因檢測(cè)，分析其與CML的相關(guān)性，為以后對(duì)CML患者研究提供分子學(xué)依據(jù)。

資料和方法

1 一般資料 所有CML病例均為我院2012年8月至2014年6月住院病人，均經(jīng)骨髓涂片和活檢診斷證實(shí)，其中男85例,女83例，年齡14～70歲，中位年齡55歲。對(duì)照組113例,男60例，女53例,均為非MCL患者，年齡20～65歲,中位年齡39歲。所有臨床資料及標(biāo)本均在取得患者知情同意后采集。

2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀采用美國(guó)伯樂(lè)CFX96，RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒天根生化科技有限公司，融合基因試劑盒(BCR-ABL)購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。

3 檢測(cè)方法 抽取患者骨髓或者靜脈血5.0ml加入裝有EDTAK2作為抗凝劑的試管中，混勻，將標(biāo)本通過(guò)使用紅細(xì)胞裂解液除去血液(骨髓)中的紅細(xì)胞，獲得白細(xì)胞；用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒從上步獲得的白細(xì)胞沉淀中提取RNA。將核酸熒光PCR混合液分別與等人份的RT-PCR酶混合，震蕩混勻數(shù)秒，3000r/min離心5s。將上述配制好的體系置于PCR管中，然后將提取好的RNA、DEPC-H2O、對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品分別加入對(duì)應(yīng)管內(nèi)。反應(yīng)管置于熒光PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)：45℃×20 min→95℃×5 min，再按95 ℃×15s→58 ℃×30 s→72 ℃×45 s,循環(huán)45次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在58℃。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行，同時(shí)做內(nèi)參，陽(yáng)性和陰性對(duì)照，均在控。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 部分標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 見(jiàn)圖1。

2 CML患者BCR-ABL突變情況 168例CML患者BCR-ABL陽(yáng)性156例(92.9%)，BCR-ABL陰性12例(7.1%)。對(duì)照組113例非MCL者BCR-ABL陽(yáng)性3例(2.7%)，BCR-ABL陰性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

Amplification為擴(kuò)增曲線，Cycles為循環(huán)數(shù)，Log Scale為對(duì)數(shù)范圍

表1 CML患者Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BCR-ABL突變率

注：與對(duì)照組突變率比較，*P<0.01

3 BCR-ABL陽(yáng)性和陰性組在臨床參數(shù)上的差異 BCR-ABL陽(yáng)性組男性高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽(yáng)性組的平均年齡和白細(xì)胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CML患者臨床參數(shù)分析：CML患者臨床參數(shù)包括確診時(shí)血常規(guī)檢查、年齡、性別，見(jiàn)表2。

表2 BCR-ABL陽(yáng)性與陰性CML患者臨床特點(diǎn)及血液學(xué)參數(shù)比較

注：與BCR-ABL陰性比較，*P<0.05，△P<0.01

討 論

我國(guó)1986-1988年對(duì)22個(gè)省、市、自治區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查表明，CML年發(fā)病率為0.36/10萬(wàn)，占白血病的第3位。各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而明顯增加，發(fā)病年齡五、六十歲。近年隨著診斷技術(shù)的提高，診斷年齡有年輕化趨勢(shì)，男性發(fā)病略高于女性。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病患者，是CML最重要特征性標(biāo)志，是疾病狀態(tài)的決定性因素，對(duì)CML的診斷具有重要意義。因此，對(duì)CML與BCR-ABL融合基因之間相關(guān)性的研究也越來(lái)越重要[4]。

BCR基因由于易位與ABL基因形成BCR-ABL融合基因，該基因的表達(dá)激活了酪氨酸蛋白激酶，擾亂了正常的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制了凋亡的發(fā)生。BCR基因由于斷裂點(diǎn)不同分為:主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)[5-6]。M-bcr和m-bcr，倆者可以單獨(dú)存在或同時(shí)存在，見(jiàn)于絕大多數(shù)的CML；少數(shù)患者表達(dá)m-bcr，多見(jiàn)于ALL；更為少見(jiàn)的CML患者表達(dá)μ-bcr。因此，對(duì)于CML患者需要進(jìn)行BCR-ABL融合基因的全面篩查，以免漏診。

基因檢測(cè)對(duì)臨床的診斷及治療發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)BCR-ABL融合基因的表達(dá)情況，敏感性好，穩(wěn)定性高，可操作性強(qiáng)，對(duì)臨床檢驗(yàn)具有普遍意義，值得推廣。馮術(shù)青等[7]研究證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR是評(píng)估CML患者治療后復(fù)發(fā)情況的良好方法，通過(guò)BCR-ABL水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可篩選出高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者，配合早期干預(yù)性治療措施可以提高患者無(wú)病生存率。本研究結(jié)果表明CML患者BCR-ABL陽(yáng)性率為92.9%，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而提示對(duì)CML患者進(jìn)行BCR-ABL檢測(cè)有重要的臨床價(jià)值，可為患者的診斷判斷提供一定幫助。本研究結(jié)果略低于其他研究者結(jié)果，可能與標(biāo)本數(shù)量少，目前RNA的提取、標(biāo)準(zhǔn)品、引物等沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，所以才導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果會(huì)有一定的差異。其中，BCR-ABL陽(yáng)性組男性高于女性，陽(yáng)性組的平均年齡和白細(xì)胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可為以后CML的深入研究進(jìn)一步提供幫助。對(duì)于存在BCR-ABL陽(yáng)性的患者給予早期的干預(yù)治療，對(duì)疾病獲得良好的結(jié)果有重要意義。

BCR-ABL融合基因可結(jié)合臨床表現(xiàn)、外周血、骨髓形態(tài)、骨髓病理、染色體等檢查，將CML分為慢性期(CP)、加速期(AP)、急變期(BP)。同時(shí)，在監(jiān)測(cè)分子靶向治療療效和異基因造血干細(xì)胞移植療效方面也有重要的作用。許蘭平等[8]分析64例造血干細(xì)胞移植的CML患者，根據(jù)BCR-ABL監(jiān)測(cè)結(jié)果，在移植后期進(jìn)行了干預(yù)治療，結(jié)果顯示伊馬替尼組、免疫調(diào)節(jié)治療組、聯(lián)合治療組患者BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)陰率分別為86.0%、90.0%、83.9%。

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(收稿：2015-12-15)

*陜西省自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014JM2-8182)

白血病，粒細(xì)胞，慢性/免疫學(xué) @BCR-ABL基因 基因融合 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

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A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.039

△通訊作者