馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

紅豆杉中紫杉烷類成分含量測定方法研究進(jìn)展

馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

紫杉醇是紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)中一種優(yōu)良的天然抗癌成分，但因其在紅豆杉中的含量極少而不能得到廣泛推廣應(yīng)用。紫杉烷類化合物作為合成紫杉醇的前體，近年來備受關(guān)注。對(duì)紫杉烷類化合物含量測定方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)；紫杉烷類；含量測定方法；研究進(jìn)展

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)是遠(yuǎn)古第四紀(jì)冰川遺留下來的古老植物，有著250萬年的悠久歷史，為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，自然分布極少。紅豆杉樹全身是寶，其莖、葉、枝、果實(shí)、心木、皮均可入藥，因此又被稱為“黃金樹”[1～3]。紅豆杉主要含有紫杉烷類、黃酮類、倍半萜等多種化學(xué)成分，其中紫杉烷類包括紫杉醇及2種重要前體巴卡亭Ⅲ(BⅢ)和10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)，紫杉醇是近40a來發(fā)現(xiàn)的存在于紅豆杉中的一種有效天然抗癌活性成分，臨床上已被成功應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療。由于紫杉醇在紅豆杉中的含量甚微，因此作為紫杉醇的合成前體紫杉烷類化合物具有廣闊的研究前景[4]。為此，筆者對(duì)紫杉烷類化合物含量測定方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以為紫杉烷類化合物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 紅豆杉中紫杉醇含量的測定

1.1高效液相色譜法

何法霖等[5]建立了一種高效液相色譜法測定加拿大紅豆杉浸膏中紫杉醇含量的方法，實(shí)驗(yàn)條件選擇PFP柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測波長227nm，室溫條件，進(jìn)樣5μL，圖譜采集時(shí)間45min。方法中考察了檢測波長、流動(dòng)相組成和提取方法3個(gè)因素，選擇了多種不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水和乙腈-水等流動(dòng)相體系，結(jié)果以甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)等效洗脫的分離效果最佳。通過在190～550nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在227nm處有最大吸收，因此確定227nm作為檢測波長。蔡玉梅等[6]采用HPLC法測定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)條件設(shè)置為AngilentHypersilODS2柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動(dòng)相，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為227nm，進(jìn)樣量10μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫杉醇和三尖杉寧堿結(jié)構(gòu)比較相近，較難分離，對(duì)比發(fā)現(xiàn)以HypersilODS2柱效果為好，含量測定方法準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可以測定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量。

高效液相色譜法(HPLC)測定紫杉醇及其他紫杉烷類化合物的含量，具有高效能、高速速的分離檢測特點(diǎn)，其分析過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是流動(dòng)相組成和比例、洗脫方式等，這種方法因具有靈敏度高、適用范圍廣、分析速度快且不破壞樣品等優(yōu)勢在含量分離分析方面得到廣泛應(yīng)用。

1.2固相萃取-反相高效液相色譜法

李儉等[7]采用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定了南方紅豆杉不同部位中紫杉醇的含量。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)條件設(shè)置為：甲醇-乙腈-水(22∶36∶42)為流動(dòng)相，流量為1.0mL/min，230nm為檢測波長，進(jìn)樣10μL，圖譜采集時(shí)間為10min。實(shí)驗(yàn)采取一次性固相萃取柱純化，配合使用標(biāo)準(zhǔn)溶液過C18小柱,進(jìn)樣量1mL，分別用10mL水、2mL50%甲醇溶液連續(xù)洗脫5次，繼續(xù)用1.5mL的80%甲醇溶液連續(xù)洗脫5次，分別收集各次洗脫液進(jìn)行色譜分析。結(jié)果表明，固相萃取相對(duì)于液-液萃取法、硅膠柱層析法或硅膠薄板層析法等方法效果較好，能在不洗脫紫杉醇的前提下最大限度地洗脫雜質(zhì)而后將紫杉醇完全洗脫。

2 紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)含量的測定

紫杉烷類化合物為合成紫杉醇或其類似物的前體，能合成比自身抗癌活性更高的物質(zhì)。紫杉烷萜類化合物主要存在于紅豆杉樹枝、葉等部位中，其含量可達(dá)紫杉醇的數(shù)十倍之多，其中，10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)就是一種常見的紫杉烷類化合物，可用于合成比紫杉醇等具有更高抗癌活性的紫杉醇類似物[7]。因此，對(duì)紅豆杉資源中紫杉烷類物質(zhì)含量測定方法進(jìn)行研究具有重要意義。

2.1高效液相色譜法

胡杰等[8]采用HPLC法測定了東北紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：以C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)為色譜柱，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動(dòng)相，檢測波長選擇234nm，檢測溫度32℃，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為10μL。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了多種流動(dòng)相體系，通過對(duì)比不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫的流動(dòng)體系條件下的檢測結(jié)果，確定了甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)作為流動(dòng)相，因其分離效果和重現(xiàn)性相對(duì)較高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用該法測定10-DABⅢ的含量結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于監(jiān)控質(zhì)量或?yàn)樾滤幍难芯块_發(fā)提供依據(jù)。安春志等[9]應(yīng)用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定了云南紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件選擇C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)為流動(dòng)相，檢測波長227nm。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多種流動(dòng)相體系如不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)大多液相條件在4min出峰，而甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)在13min左右出峰。另外，為降低成本和減少毒性，采用乙醇代替甲醇，效果良好。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法可靠簡便、重現(xiàn)性好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，具有較高實(shí)用價(jià)值，對(duì)建立紅豆杉提取物中紫杉烷萜類10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ的指紋圖譜和質(zhì)量控制較為實(shí)用。

2.2固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法

孔繁晟[10]采用固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法測定云南紅豆杉枝葉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。實(shí)驗(yàn)及色譜條件為：固相萃取柱為Agilent ODS C18500mg/3mL，色譜柱為Agilentzorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-乙腈( 35∶55∶10)，流速設(shè)置為1.0mL/min，檢測波長227nm，柱溫30℃。固相柱的洗脫溶液分別是0.01mol/L的乙酸銨、40%的甲醇乙酸銨溶液、80%的甲醇乙酸銨溶液40mL淋洗，最后用甲醇溶液淋洗固相柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在1.6～8.0μg/mL范圍內(nèi)，10-DABⅢ的線性關(guān)系良好，此法可用于紅豆杉枝葉中10-DABⅢ的含量測定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)用固相柱對(duì)樣品進(jìn)行處理后再進(jìn)行含量測定，既可以去除雜質(zhì)又能有效保護(hù)色譜柱，方法穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3反相高效液相色譜法(RP-HPLC)

甄鏵[11]采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定了歐洲紅豆杉中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫(0→27min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20%→50%)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測波長232nm；進(jìn)樣量20μL。理論塔板數(shù)按10-DABⅢ峰計(jì)算不低于10000。實(shí)驗(yàn)中10-DABⅢ在乙腈-水中易溶，進(jìn)行HPLC分析時(shí)，10-DABⅢ保留時(shí)間隨乙腈的比例升高而縮短，因此實(shí)驗(yàn)通過調(diào)整乙腈的比例來改變10-DABⅢ的分離度。實(shí)驗(yàn)在制樣方法和用硅膠柱層析中有針對(duì)性地對(duì)10-DABⅢ粗分離進(jìn)行了研究，該方法具有過程簡單、續(xù)制樣、效率高、重現(xiàn)性好、成本低、低檢出等優(yōu)點(diǎn)，簡化HPLC分析的前處理，能得到滿意的效果。甄樺等[12]采用反相高效液相色譜法測定曼地亞紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量，色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；檢測波長232nm；靈敏度0.16AUFS。在該色譜條件下，10-DABⅢ對(duì)照品保留時(shí)間為10min，理論塔板數(shù)12918。10-DABⅢ的色譜峰與鄰近峰的分離度大于1.5，分離度良好。實(shí)驗(yàn)過程簡單，所需條件容易實(shí)現(xiàn)，所以是測定10-DABⅢ含量的方法之一。

2.4超高液相色譜法(UPLC)

張靜等[13]采用UPLC法同時(shí)測定曼地亞紅豆杉中10-DABⅢ、三尖杉寧堿和紫杉醇的含量，并對(duì)不同采收期、不同部位曼地亞紅豆杉中這3種有效成分的含量變化規(guī)律進(jìn)行了研究分析。色譜條件為：色譜柱為AC-QUITY UPLC BEH Shield RP 18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8min，78%A；8～11min，78%A→65%A；11～44min，65%A)；流速0.2mL/min，檢測波長227nm，柱溫25℃；進(jìn)樣量1μL。該色譜條件下，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，分離度良好，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)均大于30000，能夠滿足分析需求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法可以用來測定紫杉烷類含量。

3 結(jié)語

SPE-HPLC法、RP-HPLC法、UPLC法等是近年來紫杉烷類化合物含量測定的常用方法，這些方法各有特點(diǎn)。不難發(fā)現(xiàn)，紫杉烷類化合物的測定方法以高效液相色譜法為多，高效液相色譜法具有高效能、高速度、高靈敏度、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。所用流動(dòng)相中多含有乙腈和水，分離效果較好，采用乙腈系統(tǒng)流動(dòng)相時(shí)，柱壓較低，洗脫能力較強(qiáng)，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱性好。由于紫杉醇藥材的昂貴性以及特殊的生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域越來越多地受到重視，而發(fā)展快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確的活性物質(zhì)含量測定方法則是研究開發(fā)和應(yīng)用紫杉醇的基礎(chǔ)。

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2017-05-16

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A313)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201612216094)；安徽新華學(xué)院校級(jí)自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(2016zr008)。

馮學(xué)花(1979-)，女，碩士，副教授，主要從事藥物分析研究，fxh77@126.com。

[引著格式]馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，等.紅豆杉中紫杉烷類成分含量測定方法研究進(jìn)展J.長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(18)：51～53.

Q949.66;R927.2

A

1673-1409(2017)18-0051-03

[編輯] 余文斌