朱欣鳳， 張亦凡， 張銀志， 孫秀蘭， 王軼凡， 李 影

泰拉霉素完全抗原的合成和鑒定

朱欣鳳1，2， 張亦凡3， 張銀志*2， 孫秀蘭1，2， 王軼凡1， 李 影1

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；3.陜西省漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 漢中723000）

利用丁二酸酐法對(duì)泰拉霉素的羥基衍生化，引入游離羧基，合成泰拉霉素半抗原。采用活潑酯法將泰拉霉素半抗原分別與牛血清白蛋白（BSA）和雞卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，合成人工完全抗原泰拉霉素-BSA和泰拉霉素-OVA。利用LC-MS鑒定衍生化后半抗原的合成，利用熒光光譜、考馬斯亮法鑒定完全抗原的合成。用泰拉霉素-BSA免疫小鼠，采用間接ELISA法測(cè)定小鼠抗血清效價(jià)。泰拉霉素半抗原和 BSA的偶聯(lián)比為 17∶1。三免后小鼠抗血清效價(jià)可達(dá)1∶8 000。

泰拉霉素；完全抗原；ELISA；鑒定

泰拉霉素（Tulathromycin，C41H79N3O12），是中國(guó)2008年批準(zhǔn)使用的一種動(dòng)物專用的半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]。泰拉霉素藥效強(qiáng)、用量少，將會(huì)逐漸替代已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的泰樂菌素和替米考星等現(xiàn)有的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，應(yīng)用潛力巨大。但抗生素殘留一直是公眾關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)問題，抗生素殘留會(huì)危害人體健康，并對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生惡劣影響，為此有必要研究泰拉霉素的殘留快速檢測(cè)的分析方法。目前主要利用放射性標(biāo)記測(cè)定法和HPLC-MSMS測(cè)定泰拉霉素殘留[2-5]。后者較為常用，但是樣本前處理復(fù)雜、測(cè)定過程繁瑣、儀器使用成本高，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢的要求。而免疫分析方法的優(yōu)勢(shì)十分明顯：樣本前處理簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備費(fèi)用低，靈敏度高[6]。因此適合抗生素殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩選和大量樣品快速檢測(cè)。但是目前國(guó)內(nèi)外還沒有泰拉霉素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ELISA）的相關(guān)報(bào)道。作者首次成功合成了泰拉霉素完全抗原。首先將泰拉霉素改造為具有活性羧基的半抗原，采用活潑酯法合成免疫原泰拉霉素-BSA和包被原泰拉霉素-OVA，為泰拉霉素檢測(cè)試劑盒的研制開辟了道路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泰拉霉素、丁二酸酐、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、碳二亞胺鹽酸鹽（EDC.HCL）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、弗氏完全佐劑、明膠、弗氏不完全佐劑：購(gòu)自sigma公司；羊抗鼠二抗（Jackson）；吡啶、甲醇、乙酸乙酯、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）：AR，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTeK型酶標(biāo)儀：柏騰公司產(chǎn)品；F-7000型熒光光度計(jì)：日立公司產(chǎn)品；磁力攪拌器：Ika公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)UV-1800：津島公司產(chǎn)品；LC-MS：Waters公司產(chǎn)品；八道可調(diào)移液器：Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠：購(gòu)自蘇州蘇普思生物科技有限公司。

1.4 泰拉霉素抗原合成

1.4.1 泰拉霉素半抗原合成 泰拉霉素結(jié)構(gòu)中有自由的羧基，因此通過琥珀酸酐法衍生而引入羧基[7]。取4 mg泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶于500 μL無(wú)水吡啶中，加入1 mg丁二酸酐，114℃回流攪拌反應(yīng)6 h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液得泰拉霉素衍生物。

1.4.2 泰拉霉素抗原的合成 完全抗原的合成采用活潑酯法[8]。將泰拉霉素衍生得到的上述產(chǎn)物、0.6 mg EDC、0.4 mg NHS溶于300 μL DMF，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min。將6 mg BSA溶于2 mL PBS，把活化好的泰拉霉素衍生物邊攪拌邊逐滴加入BSA溶液中，4℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS透析3 d，每6 h換一次液。

包被原用OVA作為載體蛋白，合成方法一樣。

1.5 泰拉霉素半抗原的鑒定

利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)半抗原進(jìn)行鑒定。

液相色譜檢測(cè)條件如下：液相色譜柱ZORBAX SB-C18，（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（水）∶V（甲醇）=65∶35；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相流量：1.0 mL/ min；柱溫為30℃。

質(zhì)譜條件：電離模式為 （ESI+），檢測(cè)模式：V模式；毛細(xì)管電壓：3.5 kV，錐孔電壓：20 V，檢測(cè)器電壓：1 600 V，離子源溫度：100℃，脫溶劑氣溫度：250℃。

圖1 泰拉霉素半抗原合成路線Fig.1 Illustration of synthesize reactions of Tulathromycin hapten

圖2 泰拉霉素完全抗原合成路線Fig.2 Illustration of synthesize reactions of the complete antigen of Tulathromycin

1.6 泰拉霉素完全抗原的鑒定

1.6.1 熒光光譜 用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇PBS溶液做稀釋液，分別取0.1 mg/mL BSA、0.01 mg/mL泰拉霉素和0.1 mg/mL BSA的混合物，0.1 mg/m LBSA-泰拉霉素偶聯(lián)物，0.01 mg/mL泰拉霉素于1 cm石英比色皿中。體積分?jǐn)?shù)50%甲醇PBS溶液為空白對(duì)照。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm，激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫寬度均為5 nm，掃面速度為300 nm/min，掃描范圍300~500 nm，進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描測(cè)定[9]。

1.6.2 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)偶聯(lián)率 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白中游離氨基[10]。分別取1 mg/mL BSA蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，加蒸餾水定容至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250染液5 mL，靜置10 min，595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。相同方法測(cè)定一系列濃度梯度的偶聯(lián)物吸光度。

1.7 動(dòng)物免疫

按照100 μg/只的劑量，通過皮下注射的途徑免疫5只雌性Balb/c小鼠。首次免疫時(shí)將免疫原與完全弗氏佐劑按照1∶1的比例混合乳化。以后將免疫原與不完全弗氏佐劑按照1∶1的比例混合乳化，每間隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。

1.8 效價(jià)測(cè)定

3次注射免疫后尾部取血利用間接法測(cè)效價(jià)[11]。利用棋盤法確定包被原泰拉霉素-OVA、抗體、酶標(biāo)二抗的濃度。ELISA的操作流程如下：用碳酸鹽緩沖液CBS（pH 9.6，）將包被原稀釋到一定濃度，每孔加入100 μL，4℃包被過夜?？装逵肞BST洗滌后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的明膠封閉，洗滌液洗3次，拍干。加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋血清各50 μL，作為37℃下孵育1 h，洗滌4次，拍干。加入一定濃度的酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，37℃孵育30 min后，洗滌拍干，加入底物液和顯色液，作用15 min后，加入終止液。用酶標(biāo)儀測(cè)各孔A450nm值。以未免疫的小鼠的血清作為陰性對(duì)照，P/N2.1判定為陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)血清的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液質(zhì)聯(lián)用鑒定

液質(zhì)連用儀采用EI離子源，泰拉霉素的相對(duì)分子質(zhì)量為 806.08，丁二酸酐相對(duì)分子質(zhì)量為100.07。根據(jù)推測(cè)，泰拉霉素結(jié)構(gòu)中的羥基與丁二酸酐反應(yīng)后得到的衍生物相對(duì)分子質(zhì)量理論值為906.08。由圖3中的質(zhì)譜圖可以看出衍生物質(zhì)荷比為906.6的峰，與理論值一致，證明成功引入了羧基，可以進(jìn)行下一步完全抗原的制備。

2.2 熒光光譜鑒定

利用熒光光譜鑒定完全抗原，結(jié)果見圖3。牛血清白蛋白上的色氨酸、酪氨酸殘基會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)BSA的酪氨酸、色氨酸殘基上的伯氨基與小分子抗原的羧基以酰胺鍵偶聯(lián)后，BSA的熒光光譜會(huì)改變。由圖4可見，BSA-泰拉霉素偶聯(lián)物熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯低于同濃度的牛血清白蛋白的熒光發(fā)射強(qiáng)度，對(duì)照泰拉霉素及泰拉霉素和BSA混合物的熒光光譜可以初步鑒定泰拉霉素和BSA偶聯(lián)成功。

2.3 考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)偶聯(lián)率

由于泰拉霉素在紫外可見光區(qū)沒有特征吸收，所以考慮考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)偶聯(lián)率?？捡R斯亮藍(lán)G-250染液與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基結(jié)合，因此可根據(jù)BSA本身固有的自由氨基酸數(shù)目和BSA偶聯(lián)小分子后結(jié)構(gòu)中剩余的自由氨基酸數(shù)目來測(cè)定偶聯(lián)率[12]。

圖3 泰拉霉素半抗原合成的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.3 LC-MS/MS result of Tulathromycin hapten

圖4 BSA及泰拉霉素-BSA偶聯(lián)物的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectrometry of BSA and BSATulathromycin

A=（εbN/M）C，其中A為吸光度值，εb為摩爾吸光系數(shù)，N為每個(gè)BSA自由氨基酸數(shù)目，C為蛋白濃度，M為BSA或BSA-泰拉霉素的相對(duì)分子質(zhì)量。

得 ABSA=（εbNBSA/MBSA）CBSA

ABSA-AT=（εbNBSA-T/MBSA-T）CBSA-T

KBSA=ABSA/CBSA=εbNBSA/MBSA

KBSA-T=ABSA-T/CBSA-T=εbNBSA-T/MBSA-T

其中，K為直線斜率

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 NBSA=60，MBSA=66 430，MT= 806.08，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得KBSA=0.007 3，KBSA-T=0.005 6，由此得出泰拉霉素與BSA的偶聯(lián)比約為17∶1。

2.4 抗體效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA測(cè)定小鼠血清效價(jià)。三免后以1 μg／mL包被抗原包板，3號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，達(dá)到1∶8 000，測(cè)定結(jié)果見表1，1號(hào)和5號(hào)小鼠血清效價(jià)為1∶4 000，2號(hào)小鼠血清效價(jià)為1∶2 000。其中3號(hào)小鼠抗血清的IC50為98.5 μg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明了人工抗原泰拉霉素-BSA和泰拉霉素-OVA的合成是成功的。

表1 3號(hào)小鼠抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 1 Titration of the third mouse’s antiserum

3 結(jié)語(yǔ)

相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000的小分子物質(zhì)通常不具有免疫原性，進(jìn)入生物體內(nèi)后并不能誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，這樣的小分子必須與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原后才具有免疫原性[13-14]?？疾焯├顾亟Y(jié)構(gòu)后決定通過泰拉霉素的羥基與丁二酸酐反應(yīng)，從而引入羧基，然后偶聯(lián)載體蛋白，形成完全抗原。通過質(zhì)譜鑒定可以確認(rèn)半抗原衍生后產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為906.6，與理論值基本一致。證明了半抗原衍生化成功。通過熒光光譜確認(rèn)載體蛋白與泰拉霉素成功偶聯(lián)。鑒于泰拉霉素沒有紫外吸收，故利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得偶聯(lián)率為17∶1。有報(bào)道，偶聯(lián)比在1∶8~1∶20的完全抗原的免疫效果較好，但根據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，偶聯(lián)比的多少與抗體效價(jià)和特異性沒有特定的直接關(guān)系。蛋白和半抗原經(jīng)驗(yàn)證確實(shí)偶聯(lián)成功后可以免疫小鼠，作者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證完全抗原的合成確實(shí)是成功的。實(shí)驗(yàn)證明其免疫效果良好，合成工藝簡(jiǎn)單，為泰拉霉素免疫分析方法的建立和檢測(cè) 試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1]KANG Jijun，WANG Lixia，ZENG Zhengling.A new macrolide antibiotic tulathromycin for animals[J].Guangdong Journal of Animal and Veterinary Science，2010，35（2）：7-10.（in Chinese）

[2]HUANG X H，ZHAO Y D，HE L M，et al.Development of high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of tulathromycin in swine plasma[J].Journal of Integrative Agriculture，2012，11（3）：465-473.

[3]GAJDA A，A POSYNIAK，ZMUDZKI J，et al.The development of analytical procedure for the determination of tulathromycin in swine plasma[C]//Egmond aan Zee.Residues of veterinary drugs in food.Proceedings of the EuroResidue VII Conference.The Netherlands：Board of the EuroResidue Conferences Foundation，2012：14-16

[4]NI H J，HUANG X H，F(xiàn)ANG B H，et al.Determination of tulathromycin in pork tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis，2011（3）：19.

[5]BONER P L，GOTTSCHALL D W，KIM-KANG H.Determination and confirmation of tulathromycin residues in bovine liver and porcine kidney via their common hydrolytic fragment using high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J].Journal of AOAC International，2011，94（2）：436-445.

[6]LIN Ying，YE Mao，HAN Shuangyan，et al.The progress on the research of immunoassay[J].Joural of Food Sciene and Biotechnoloy，2007，26（4）：117-120.（in Chinese）

[7]孝莊，曼霽.蛋白質(zhì)連接技術(shù)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1993.

[8]楊利國(guó)，魏平華，郭愛珍，等.酶免疫測(cè)定技術(shù)[M].南京：南京大學(xué)出版社，1998.

[9]ZHANG Lifang，LI Weiling，JIANG Zhaoleng，et al.Identification of hapten-carrier protein conjugate by fluorescence spectrometry[J].Chinese Journal of Veterinary Medicine，2014（7）：81-83.（in Chinese）

[10]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

[11]LIU F，LOU Y，SHI X，et al.Preparation and characterization of monoclonal antibody specific for copper-chelate complex[J]. Journal of Immunological Methods，2013，387（1）：228-236.

[12]WU Ding，LIU Changquan.Determination of ampicillin content in milk by ELISA[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2000，10（1）：10-20.（in Chinese）

[13]廷彬，學(xué)念.實(shí)用免疫學(xué)[M].長(zhǎng)春：長(zhǎng)春出版社，1994.

[14]XU Liguang，KUANG Hua，SONG Shanshan，et al.Synthesis and characterization of antigen of furazolidone[J].Joural of Food Sciene and Biotechnoloy，2013（11）：1136-1140.（in Chinese）

Synthesis and Identification of Complete Antigen of Tulathromycin

ZHU Xinfeng1，2， ZHANG Yifan3， ZHANG Yinzhi*2， SUN XiuLan1，2， WANG Yifan1， LI Ying1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，WuXi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Techology，Jiangnan Uniersity，WuXi 214122，China；3.Hanzhong Productus Quality Supervision and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China）

The complete antigen of Tulathromycin was synthesized in this study.The Tulathromycin haptens were obtained by deriving the mycotoxins with succinic anhydride，introducing the free carboxyl group.The EDC method was applied to conjugate the Tulathromycin haptens to bovine serum albumin （BSA）as an artificial immunogen.The coating antigen Tulathromycin-OVA was achieved in the same way.The synthetic hapten was identified by LC-MS.Tulathromycin-BSA was characterized by fluorescence spectrometry and Bradford method.The antiserum titer was detected by indirect ELISA for BALB/c mice immunized with Tulathromycin-BSA.The conjugated-ratio of BSA was determined as 17∶1.The antiserum titer of the BALB/C mice reached to 1∶8 000 after the third Booster immunization.The complete antigens were successfully synthesized，which laid a foundation for the development of the Tulathromycin ELISA kit.

Tulathromycin，complete antigens，ELISA，identification

O 657

A

1673—1689（2017）01—0062—05

2015-03-02

2010年度公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003008-08）。

*通信作者：張銀志（1975—），男，高級(jí)工程師，主要從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：yinzhizhang@jiangnan.edu.cn

朱欣鳳，張亦凡，張銀志，等.泰拉霉素完全抗原的合成和鑒定[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（01）：62-66.