孫家亮 綜述 李大力，張學(xué)利 審校

（1. 上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院 普通外科，上海 201499；2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241）

結(jié)直腸癌是當(dāng)前世界上病死率第4位的惡性腫瘤，每年近70萬人死于結(jié)直腸癌。在中國，隨著生活水平提高，生活方式西化，中國人的結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年遞增[1]。目前，臨床上對于結(jié)直腸癌通常以手術(shù)治療為主，部分晚期結(jié)直腸癌以放化療為主且效果不佳。為研究結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性以及提高藥物治療的效果，當(dāng)前腫瘤研究主要以結(jié)直腸癌細胞系（colorectal cancer cell lines，CCL）和患者來源的腫瘤異種移植（patientderived tumor xenografts，PDTX）模型為主來模擬腫瘤的發(fā)展情況以及對藥物的反應(yīng)。但由于人體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，腫瘤發(fā)生發(fā)展機制不明確，使這兩種模型的模擬效果和精準度與體內(nèi)腫瘤的發(fā)展有一定的差距。從而導(dǎo)致許多基礎(chǔ)研究中的藥物與臨床實用的效果差距較大，很多腫瘤亞型的患者沒有高效的藥物治療。本文所描述的類器官模型能很好的保留腫瘤細胞的異質(zhì)性以及對藥物的反應(yīng)。

1 CCL

腫瘤細胞系模型是一種重要的癌癥研究方法。大多數(shù)CCL都是來源于其惡性腫瘤本身或轉(zhuǎn)移的樣本中。目前的CCL系約有30余種，其中最常用的分別為：SW480、SW620、HCT116、T84、HT29、LS174T、INT-407、HT20-MTX及NCM460等[2-3]。腫瘤細胞系具有同源性、無限增殖能力、簡單培養(yǎng)及可應(yīng)用于高通量藥物篩選等大量的實驗優(yōu)勢。阻礙CCL更廣泛地應(yīng)用是其存在交叉污染，基因型的不穩(wěn)定性，質(zhì)量控制的差異，以及容易受微生物感染等因素，因此無法全面的應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究的各個方面。加之建立的腫瘤細胞系大多來源于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶或進展較快的腫瘤，因此原發(fā)性或進展緩慢的腫瘤無法得以科學(xué)準確地認識與研究[4-5]。

2 PDTX

PDTX模型是將手術(shù)切除或活檢新鮮腫瘤組織直接種植于免疫缺陷小鼠的皮下原位或腎囊膜下[6]。當(dāng)腫瘤進入體內(nèi)的生理環(huán)境中，盡管具有異質(zhì)性，但模擬原發(fā)的腫瘤的條件更優(yōu)于在培養(yǎng)皿中，同時基因變異也越來越少[7]。移植瘤在連續(xù)傳代后也能夠保持它們原代腫瘤的組織特異性，此外，一些亞克隆間平行生長也能夠部分保持原代腫瘤的異質(zhì)性[8]。這些優(yōu)勢使PDTX成為一個有效的臨床前模型，能夠完成一系列包括藥物的有效性篩查、預(yù)測新的腫瘤生物標記物等生物研究[9-10]。盡管PDTX作為腫瘤研究的臨床前模型有巨大優(yōu)勢，但是仍有一些缺陷。首先，人源惡性腫瘤移植成功率不能達到最滿意效果，而移植瘤需要長時間生長，同時受體間存在個體差異且缺乏免疫能力，這也會導(dǎo)致原代腫瘤的生物學(xué)行為發(fā)生變化，使其惡性程度提高及侵襲能力增加。在某些情況下，移植瘤不能很好的預(yù)測患者的無病生存率[11]。其次，盡管PDTX與原代腫瘤有相似性，但它仍不能被用于一些嚴格的實驗指標檢測。腫瘤與宿主反應(yīng)不能在物種間保存，有些腫瘤的免疫反應(yīng)也完全缺失[12]。最后，使用動物移植模型需要消耗大量時間、精力、成本高，且涉及倫理問題。目前在體外建立的結(jié)直腸類器官模型可以很好的與上述兩中模型相為補充，為結(jié)直腸腫瘤的研究提供新的途徑。

3 類器官概述

類器官模型是近年來興起的一種新的臨床前疾病研究模型。在體外用各種必要的生長因子來模擬機體內(nèi)環(huán)境的條件下，提取腸干細胞加入到3D基質(zhì)膠中培養(yǎng)從而得到了細胞團塊樣組織，其包含了不同組織來源的上皮細胞結(jié)構(gòu)，這種能不斷自我增殖及分化的細胞團被稱之為類器官[13]。這種在類似生理情況下培養(yǎng)的類器官模型能夠在體外研究模擬一系列體內(nèi)的生物學(xué)行為，像組織更新、干細胞功能、細胞對藥物反應(yīng)、損傷性研究、以及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[14-15]。尤其在結(jié)直腸腫瘤研究方面具有巨大優(yōu)勢：首先，無論是腸腺瘤還是腸癌均可以在體外進行腫瘤類器官的培養(yǎng)[16]。其次，腫瘤類器官的培養(yǎng)過程中僅提供給原始腫瘤細胞類似生理條件的生長環(huán)境，且一般短時間（1周左右）能擴增，故能很好的保留原代腫瘤組織固有的異質(zhì)性和生物學(xué)行為[17]。最后，這種高效率的類器官培養(yǎng)可以用來研究腫瘤的分子信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]和抗腫瘤藥物的研發(fā)與篩選[19]以及腫瘤患者的靶向治療。類器官所呈現(xiàn)出上皮的自然生理狀況優(yōu)于傳統(tǒng)的細胞系，能長期傳代培養(yǎng)且具有穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征，這些是PDTX模型所無法比擬的[20]。目前已經(jīng)成功建立一系列小鼠和人的正常組織及腫瘤組織的類器官，使其成為基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)中的重要工具[21-22]。

4 正常類器官及腫瘤類器官培養(yǎng)條件的探索

2009年，Clevers等[23]證實腸隱窩處富集腸上皮功能性干細胞，且由富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor，Lgr5）標記的隠窩柱狀細胞為腸道成體干細胞。隨后，Sato等[13]在體外沒有間質(zhì)微環(huán)境支持下用單個Lgr5標記的干細胞來建立一個隱窩-絨毛樣的微型器官樣結(jié)構(gòu)，即小腸類器官。這種出芽狀的結(jié)構(gòu)包括中間“囊樣”結(jié)構(gòu)的絨毛樣區(qū)域和周圍“芽狀”結(jié)構(gòu)的隠窩樣區(qū)域。通過染色表明這種類器官包含4種腸道常見的分化細胞，分別為隱窩區(qū)域的潘氏細胞，絨毛區(qū)域的腸細胞，腸道內(nèi)分泌細胞以及杯狀細胞。結(jié)直腸類器官成功培養(yǎng)的關(guān)鍵是在無間質(zhì)條件下，通過加入各種小腸生長所必須的生長因子來模擬小腸干細胞的培養(yǎng)微環(huán)境[24]，用基質(zhì)膠來代替小腸間質(zhì)的支架結(jié)構(gòu)成功培養(yǎng)出了小腸類器官。并摸索建立了小鼠小腸類器官培養(yǎng)的通用培養(yǎng)基（ENR），其包括：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路抑制劑（noggin），Wnt信號通路激動劑（R-spondin-1），基底膜替代物人工基質(zhì)膠（matrigel）[25]。人腸道類器官的培養(yǎng)以ENR為基礎(chǔ)，需要添加額外的生長因子，包括：Wnt信號通路的外源性配體（Wnt3a）、TGF-β抑制劑（A83-01）、p83抑制劑（SB202190）、煙酰胺（nicotinamide）及胃素（gastrin）[16,26]。在腸干細胞的信號通路中，Wnt信號在隠窩增殖中至關(guān)重要，而Wnt配體Wnt3a及激動劑R-spondin-1可協(xié)同激活此信號通路，而BMP信號抑制腸干細胞增殖，故其抑制劑Noggin能提高類器官培養(yǎng)形成率，同時加快其生長速度。EGF信號通路在腸干細胞的穩(wěn)態(tài)維持中保持重要的作用[27]。腸類器官的培養(yǎng)可以通過不同的生長因子調(diào)節(jié)來維持干細胞的活性，使類器官可以不斷增殖分化，達到模擬正常腸上皮的生理狀態(tài)。

結(jié)直腸腫瘤類器官培養(yǎng)與正常組織類器官則有所不同。在APCmin/+小鼠腫瘤模型中，其腫瘤類器官的培養(yǎng)中只需要EGF+noggin（EN）生長因子的培養(yǎng)基，因為在小鼠小腸腺瘤中包含明確的APC基因突變從而導(dǎo)致Wnt信號通路的異常持續(xù)激活，故不需額外加入Wnt的激動劑[28]。而在人的腫瘤類器官培養(yǎng)中則根據(jù)腫瘤的類型不同，其突變的信號通路不同，需要加入不同的生長因子：如為APC基因的突變而導(dǎo)致Wnt信號通路的異常激活則不需加入Wnt3a，若為RAS/MAPK信號通路突變則不需要加入EGF生長因子，當(dāng)腫瘤中有TGF-b信號通路突變后其功能受到抑制時則不需要加入A83-01來維持生長[16-17,29]。Matano等[18]用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在正常上皮類器官中突變了一系列抑癌基因APC、SMAD4、TP53和致癌基因KRAS、PI3K，這些突變類器官需要用去除相應(yīng)生長因子的選擇培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，才能產(chǎn)生相應(yīng)的腫瘤性增長。同時將這些通過基因編輯修飾的類器官移植入裸鼠的腎囊膜下和脾臟中，發(fā)現(xiàn)其有不同的成瘤和侵襲轉(zhuǎn)移能力，表明可在體外重現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[30]（圖1）。Fujii等[17]于2016年建立第一個結(jié)直腸腫瘤類器官庫（Colorectal Tumor Organoid Library，CTOL）包含55個腫瘤類器官，其來源于43例患者中的52個腫瘤，且包含各種不同的腫瘤亞型。相比于van de Wetering等[29]從結(jié)腸腺瘤患者中培養(yǎng)出類器官生物樣本庫（Organoid Biobank），結(jié)直腸癌類器官的培養(yǎng)更為復(fù)雜，尤其對于直腸癌和晚期結(jié)腸癌。一方面，由于腫瘤細胞浸潤到腸壁的深肌層即使在消化完成后依然有結(jié)締組織連接，其剩余片段的釋放需要通過額外的胰酶來裂解，這樣才能將大量的腫瘤細胞從組織中分離出來。另一方面，晚期腫瘤中基因突變的復(fù)雜性以及癌細胞對于氧濃度的敏感性不同使所需的培養(yǎng)條件與之前的方案也有差異，需要測試多種條件下3種不同因素（Wnt激動劑Wnt3A/R-spondin1，氧濃度以及p38抑制劑SB202190）對結(jié)直腸癌類器官增殖的影響[17]?？傊Y(jié)直腸腫瘤可以通過測序來檢測出不同的信號通路突變，利用測序結(jié)果將原代腫瘤在體外通過生長條件的改變來培養(yǎng)出腫瘤類器官。這種類器官組織可以將原代腫瘤的異質(zhì)性及生物學(xué)行為（包括：基因型特征，基因表達譜，移植瘤的侵襲性等）很好的保留下來。

目前也有通過胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）或誘導(dǎo)性多功能干細胞細胞（inducedpluripotent stem cell，iPS）來誘導(dǎo)產(chǎn)生腸道上皮類器官[14,31]。方法是將從胚胎中提取出來的ES細胞體外貼壁培養(yǎng)后，通過不同的生長因子來誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的內(nèi)胚層（在胃腸道中主要是間質(zhì)細胞中的Barx1來誘導(dǎo)產(chǎn)生腸內(nèi)胚層），隨后將富含腸內(nèi)胚層的多能干細胞移植入細胞外基質(zhì)中在加入各種必需的微環(huán)境生長因子來產(chǎn)生微小的胃腸道樣的類器官結(jié)構(gòu)[32-33]。這種類器官的培養(yǎng)可以用于發(fā)育生物學(xué)方面研究。

圖1 評估結(jié)腸癌中聯(lián)合突變的致癌作用[31]Figure 1 Assessment of the effects of joint mutations on carcinogenesis in colon cacer[31]

5 類器官在結(jié)直腸腫瘤研究中的應(yīng)用

5.1 模擬腫瘤發(fā)生的機制

結(jié)直腸腫瘤類器官可以模擬腸道惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的病理機制以及不同信號通路突變的作用。眾所周知，結(jié)直腸癌是由正常結(jié)腸上皮細胞累積的基因突變后使其向腺瘤-腺癌-侵襲轉(zhuǎn)移方向轉(zhuǎn)變[34]。Matano等[18,35]用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在腸上皮類器官中突變了一系列基因來模擬腸腫瘤的演化過程。Fumagalli等[36]通過采用原位移植包含不同的CRC突變聯(lián)合的人結(jié)腸類器官，來分析腺瘤-癌序列在體內(nèi)演進過程，表明了Wnt、EGFR、p53和TGF-β信號積累致瘤突變有助于有效的腫瘤生長，遷移和轉(zhuǎn)移灶形成（圖1）。相反，van de Wetering等[29]從結(jié)腸腺瘤的患者中培養(yǎng)出腺瘤類器官生物樣本庫，而Fujii等[17]培養(yǎng)了包含各種不同的結(jié)腸癌腫瘤亞型的腫瘤樣本庫（圖2）。二者從正反兩方面來論證了結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程，而且在腫瘤起始發(fā)生過程中Wnt信號通路過度激活至關(guān)重要，腫瘤后期的侵襲轉(zhuǎn)移與RAS基因突變、TP53基因失活、染色體不穩(wěn)定性（CIN）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）等均相關(guān)。

5.2 抗腫瘤藥物的研發(fā)與篩選

在腫瘤的治療過程中抗腫瘤藥物是不可或缺。傳統(tǒng)的藥物篩選只能在細胞系和小鼠模型中進行，由于細胞系的種類有限而小鼠模型不能很好的展現(xiàn)出人腫瘤的異質(zhì)性，類器官則可以彌補二者不足[38]。Verissimo等[19]在體外利用原代腫瘤類器官庫的基因多樣性來研究RAS基因突變在結(jié)直腸癌中的耐藥性機制。發(fā)現(xiàn)RAS基因突變與EGRF抑制劑有強烈的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，且RAS基因突變在抵抗抑制劑方面是將細胞周期停滯而在RAS野生型腫瘤中則發(fā)生細胞死亡。Emmink等[39]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中ABCB1positive/ALDHlow分化腫瘤細胞能夠?qū)⒁亮⑻婵担ㄍ負洚悩?gòu)酶I抑制劑）泵入到類器官的腔中從而保護ALDHlow/ABCB1positive腫瘤起始細胞免受藥物的殺傷，在正常腸上皮組織中也有類似抗藥性機制，作者推測腸上皮干細胞是多種不同類型腫瘤細胞的起源。Walsh等[40]通過定量的光學(xué)成像在原代腫瘤類器官中藥物代謝來預(yù)測乳腺癌中藥物的反應(yīng)，同時研究了在凍存后的腫瘤組織與新鮮腫瘤組織培養(yǎng)的類器官在藥物反應(yīng)方面的差別，發(fā)現(xiàn)在DMSO條件下凍存后的腫瘤類器官有更精確的藥物反應(yīng)[41]。

5.3 腫瘤靶向治療與個體化醫(yī)療

靶向治療在惡性腫瘤治療中是針對特定致癌位點（基因片段或蛋白分子）來定向殺死腫瘤細胞，從而顯著提高患者的無病生存率，靶向藥物在腫瘤晚期伴遠處臟器轉(zhuǎn)移的患者中也有效果。今后可將手術(shù)或腸鏡活組織檢查的腫瘤患者中取出部分樣本進行體外類器官培養(yǎng)，通過測序或病理檢測出病變類型來選擇靶向藥物，最后將選定的靶向藥物在腫瘤類器官中檢測對腫瘤的殺傷能力以及對正常類器官中組織的影響，從而來確定患者是否適用此種藥物[42]。在個體化醫(yī)療方面類器官也展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。囊性纖維化患者由于囊性纖維化膜轉(zhuǎn)導(dǎo)受體（cystic fibrosis transmembrane conductor receptor，CFTR）的轉(zhuǎn)運子突變而引起鐵通道離子轉(zhuǎn)運蛋白障礙，使肺泡和胃腸道上皮分泌大量粘液，導(dǎo)致感染、咳嗽、腹瀉以及體質(zhì)量下降等一般兒童期發(fā)病且癥狀持續(xù)[43]。由于CFTR缺陷類型近2 000多種故同一藥物對不同患者的療效差異很大。Clevers實驗室將1例19歲患者的腸病變類器官體外培養(yǎng)，用最新的藥物Kalydeco（一種鐵通道開放劑）作用CF類器官后，發(fā)現(xiàn)粘液分泌顯著改善，隨后患者服用藥物后癥狀顯著改善[44]。這也是目前類器官成功應(yīng)用臨床個體化治療的先例。

圖2 結(jié)直腸癌類器官模型的應(yīng)用[37]Figure 2 Application of organoid models of colorectal cancer[37]

6 腸道疾病模型建立的應(yīng)用

腸類器官不僅可用于模擬腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可用于遺傳性疾病、感染性疾病、炎癥性腸病等模型的建立。目前已經(jīng)能夠穩(wěn)定培育出從患者來源的多種類器官。在微絨毛融合性疾病及多段小腸閉鎖的這些患者來源的小腸上皮類器官上能呈現(xiàn)出混亂的細胞極性和上皮結(jié)構(gòu)[45-46]。炎癥性腸病典型特征是胃腸道管腔黏膜的廣泛炎癥發(fā)展，其發(fā)病是由于聯(lián)合了基因敏感性、免疫失調(diào)、微生物群紊亂和環(huán)境因素等[47]。類器官培養(yǎng)可用于研究細胞死亡、黏膜整合、和炎癥因子等對于炎性腸病的影響[47]。許多不同類型的微生物能導(dǎo)致胃腸道疾病或影響敏感個體的發(fā)展，類器官可以加深對個體敏感性、微生物感染病理及可能治療方案的理解[48]。Nigro等[49]用細菌產(chǎn)物、死菌體以及與宿主共生的細菌來與腸道類器官共培養(yǎng)或顯微注射的情況下，來連續(xù)性觀察類器官以及腸干細胞對細菌的反應(yīng)。在胃類器官中注射幽門螺桿菌導(dǎo)致核內(nèi)轉(zhuǎn)化因子（NF-κB）的激活，此因子可激活胃癌細胞，這一過程會導(dǎo)致炎癥因子—白介素8（IL-8）表達增加。有些幽門螺桿菌變異后表達CagA可增加胃類器官的增殖，這些可能與胃癌發(fā)生相關(guān)[50]。因此，這些研究表明類器官能模擬和加深對胃腸道疾病的理解與認識。

7 腸道類器官的局限性及展望

盡管類器官模型能展現(xiàn)出諸多的優(yōu)勢，但仍然有一些缺陷：首先，類器官系統(tǒng)包含有多種分化細胞和腫瘤干細胞，但缺乏類似體內(nèi)環(huán)境中腫瘤細胞與多種間質(zhì)細胞（如：腸神經(jīng)叢、血管內(nèi)皮、免疫細胞以及平滑肌等）共存體系，無法在體外模擬腫瘤中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transitions，EMT）等現(xiàn)象，故類器官模型仍然不能完全代表體內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展情況。其次，實驗室間培養(yǎng)方法存在差異。不同實驗室用于建立腸道類器官的組織來源，生長因子不同，導(dǎo)致類器官之間存在異質(zhì)性。最后，由于商業(yè)性生長因子價格較高，大批量研究成本較大。這些局限性限制了類器官的大批量研究與應(yīng)用。

通過類器官培養(yǎng)體系可以建立多種胃腸到微型器官模型。這種體系是多細胞性類似于體內(nèi)模型，能很好保留個體本身異質(zhì)性，且在體外培養(yǎng)中對生長條件的改變具有靈活性，能夠模擬不同疾病的發(fā)生發(fā)展情況。將基因編輯技術(shù)引入類器官模型中，使類器官在結(jié)直腸腫瘤發(fā)病機制研究與個體化治療方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。未來可優(yōu)化培養(yǎng)流程，建立標準化培養(yǎng)模式，進一步探索間質(zhì)細胞與類器官同時在體外培養(yǎng)時相互作用，來模擬與研究更多的腸道疾病?？傊?，類器官作為第三種臨床前腫瘤疾病研究模型可以與前兩種模型互為補充，為更好的結(jié)直腸腫瘤及其相關(guān)的疾病研究服務(wù)。

[1]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115–132.doi:10.3322/caac.21338.

[2]Pereira JF,Awatade NT,Loureiro CA,et al.The third dimension:new developments in cell culture models for colorectal research[J].Cell Mol Life Sci,2016,73(21):3971–3989.doi:10.1007/s00018–016–2258–2.

[3]Ahmed D,Eide PW,Eilertsen IA,et al.Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines[J].Oncogenesis,2013,2:e71.doi:10.1038/oncsis.2013.35.

[4]Masters JR.Human cancer cell lines:fact and fantasy[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2000,1(3):233–236.

[5]Masters JR.False cell lines:The problem and a solution[J].Cytotechnology,2002,39(2):69–74.doi:10.1023/A:1022908930937.

[6]Jin K,Teng L,Shen Y,et al.Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunode fi cient mice:a systematic review[J].Clin Transl Oncol,2010,12(7):473–480.doi:10.1007/s12094–010–0540–6.

[7]Daniel VC,Marchionni L,Hierman JS,et al.A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro [J].Cancer Res,2009,69(8):3364–3373.doi:10.1158/0008–5472.CAN–08–4210.

[8]Guenot D,Guérin E,Aguillon-Romain S,et al.Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability[J].J Pathol,2006,208(5):643–652.

[9]Tentler JJ,Tan AC,Weekes CD,et al.Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development[J].Nat Rev Clin Oncol,2012,9(6):338–350.doi:10.1038/nrclinonc.2012.61.

[10]Hidalgo M,Bruckheimer E,Rajeshkumar NV,et al.A pilot clinical study of treatment guided by personalized tumorgrafts in patients with advanced cancer[J].Mol Cancer Ther,2011,10(8):1311–1316.doi:10.1158/1535–7163.MCT–11–0233.

[11]John T,Kohler D,Pintilie M,et al.The ability to form primary tumor xenografts is predictive of increased risk of disease recurrence in early-stage non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(1):134–141.doi:10.1158/1078–0432.CCR–10–2224.

[12]Caponigro G,Sellers WR.Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses[J].Nat Rev Drug Discov,2011,10(3):179–187.doi:10.1038/nrd3385.

[13]Sato T,Vries RG,Snippert HJ,et al.Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche[J].Nature,2009,459(7244):262–265.doi:10.1038/nature07935.

[14]Fatehullah A,Tan SH,Barker N.Organoids as an in vitro model of human development and disease[J].Nat Cell Biol,2016,18(3):246–254.doi:10.1038/ncb3312.

[15]Sato T,Clevers H.SnapShot:Growing Organoids from Stem Cells[J].Cell,2015,161(7):1700.doi:10.1016/j.cell.2015.06.028.

[16]Sato T,Stange DE,Ferrante M,et al.Long-term expansion of epithelial organoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett's epithelium[J].Gastroenterology,2011,141(5):1762–1772.doi:10.1053/j.gastro.2011.07.050.

[17]Fujii M,Shimokawa M,Date S,et al.A Colorectal Tumor Organoid Library Demonstrates Progressive Loss of Niche Factor Requirements during Tumorigenesis[J].Cell Stem Cell,2016,18(6):827–838.doi:10.1016/j.stem.2016.04.003.

[18]Matano M,Date S,Shimokawa M,et al.Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids[J].Nat Med,2015,21(3):256–262.doi:10.1038/nm.3802.

[19]Verissimo CS,Overmeer RM,Ponsioen B,et al.Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening[J].Elife,2016,5.pii:e18489.doi:10.7554/eLife.18489.

[20]Sachs N,Clevers H.Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes[J].Curr Opin Genet Dev,2014,24:68–73.doi:10.1016/j.gde.2013.11.012.

[21]Yin X,Mead BE,Safaee H,et al.Engineering Stem Cell Organoids[J].Cell Stem Cell,2016,18(1):25–38.doi:10.1016/j.stem.2015.12.005.

[22]Clevers H.Modeling development and disease with organoids[J].Cell,2016,165(7):1586–1597.doi:10.1016/j.cell.2016.05.082.

[23]Clevers H.Searching for adult stem cells in the intestine[J].EMBO Mol Med,2009,1(5):255–259.doi:10.1002/emmm.200900034.

[24]Clevers H.The intestinal crypt,a prototype stem cell compartment[J].Cell,2013,154(2):274–284.doi:10.1016/j.cell.2013.07.004.

[25]Mahe MM,Aihara E,Schumacher MA,et al.Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids[J].Curr Protoc Mouse Biol,2013,3(4):217–240.doi:10.1002/9780470942390.mo130179.

[26]Mahe MM,Sundaram N,Watson CL,et al.Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy[J].J Vis Exp,2015,(97).doi:10.3791/52483.

[27]Sato T,Clevers H.Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell:mechanism and applications[J].Science,2013,340(6137):1190–1194.doi:10.1126/science.1234852.

[28]Xue X,Shah YM.In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors[J].J Vis Exp,2013,(75):e50210.doi:10.3791/50210.

[29]van de Wetering M,Francies HE,Francis JM,et al.Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients[J].Cell,2015,161(4):933–945.doi:10.1016/j.cell.2015.03.053.

[30]Salahudeen AA,Kuo CJ1.Toward recreating colon cancer in human organoids[J].Nat Med,2015,21(3):215–216.doi:10.1038/nm.3818.

[31]Finkbeiner SR,Freeman JJ,Wieck MM,et al.Generation of tissueengineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids[J].Biol Open,2015,4(11):1462–1472.doi:10.1242/bio.013235.

[32]Spence JR,Mayhew CN,Rankin SA,et al.Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro[J].Nature,2011,470(7332):105–109.doi:10.1038/nature09691.

[33]Noguchi TK,Ninomiya N,Sekine M,et al.Generation of stomach tissue from mouse embryonic stem cells[J].Nat Cell Biol,2015,17(8):984–993.doi:10.1038/ncb3200.

[34]Fearon ER.Molecular genetics of colorectal cancer[J].Annu Rev Pathol,2011,6:479–507.doi:10.1146/annurevpathol–011110–130235.

[35]Drost J,van Jaarsveld RH,Ponsioen B,et al.Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells[J].Nature,2015,521(7550):43–47.doi:10.1038/nature14415.

[36]Fumagalli A,Drost J,Suijkerbuijk SJ,et al.Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2017,114(12):E2357–2364.doi:10.1073/pnas.1701219114.

[37]Ohta Y,Sato T.Intestinal tumor in a dish[J].Front Med (Lausanne),2014,1:14.doi:10.3389/fmed.2014.00014.

[38]Golovko D,Kedrin D,Yilmaz ?H,et al.Colorectal cancer models for novel drug discovery[J].Expert Opin Drug Discov,2015,10(11):1217–1229.doi:10.1517/17460441.2015.1079618.

[39]Emmink BL,Van Houdt WJ,Vries RG,et al.Differentiated human colorectal cancer cells protect tumor-initiating cells from irinotecan[J].Gastroenterology,2011,141(1):269–278.doi:10.1053/j.gastro.2011.03.052.

[40]Walsh AJ,Cook RS,Sanders ME,et al.Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer[J].Cancer Res,2014,74(18):5184–5194.doi:10.1158/0008–5472.CAN–14–0663.

[41]Walsh AJ,Cook RS,Sanders ME,et al.Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues[J].Sci Rep,2016,6:18889.doi:10.1038/srep18889.

[42]Brody H.Colorectal cancer[J].Nature,2015,521(7551):S1.doi:10.1038/521S1a.

[43]Ratjen F,D?ring G.Cystic fi brosis[J].Lancet,2003,361(9358):681–689.

[44]Saini A.Cystic Fibrosis Patients Benefit from Mini Guts[J].Cell Stem Cell,2016,19(4):425–427.doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.09.001.

[45]Wiegerinck CL,Janecke AR,Schneeberger K,et al.Loss of syntaxin 3 causes variant microvillus inclusion disease[J].Gastroenterology,2014,147(1):65–68.doi:10.1053/j.gastro.2014.04.002.

[46]Bigorgne AE,Farin HF,Lemoine R,et al.TTC7A mutations disrupt intestinal epithelial apicobasal polarity[J].J Clin Invest,2014,124(1):328–337.

[47]Okamoto R,Watanabe M.Perspectives for Regenerative Medicine in the Treatment of Inflammatory Bowel Diseases[J].Digestion,2015,92(2):73–77.doi:10.1159/000438663.

[48]Schumacher MA,Aihara E,Feng R,et al.The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology[J].J Physiol,2015,593(8):1809–1827.doi:10.1113/jphysiol.2014.283028.

[49]Nigro G,Hanson M,Fevre C,et al.Intestinal Organoids as a Novel Tool to Study Microbes-Epithelium Interactions[J].Methods Mol Biol,2016.[Epub ahead of print]

[50]Bartfeld S,Bayram T,van de Wetering M,et al.In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection[J].Gastroenterology,2015,148(1):126–136.doi:10.1053/j.gastro.2014.09.042.