李華鋼，饒艷，聶華

(武漢大學中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430071)

白藜蘆醇對腦缺血大鼠突觸可塑性的影響

李華鋼，饒艷，聶華

(武漢大學中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430071)

目的 探究白藜蘆醇對腦缺血大鼠突觸可塑性的影響。方法60只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字隨機法隨機分為假手術組(Sham，n=15)，腦缺血大鼠模型組(CCH，n=15)，給予40 mg/kg白藜蘆醇預處理四周的腦缺血大鼠模型組(CCH+Resveratrol，n=15)以及白藜蘆醇處理組(Resveratrol，n=15)。采用莫里斯水迷宮檢測大鼠空間感知能力和記憶能力；透射電子顯微鏡下測量神經(jīng)元突觸界面結構參數(shù)；高爾基體染色法檢測齒狀回區(qū)樹突刺的形態(tài)學變化；Western blot檢測突觸相關蛋白的表達情況。結果CCH組大鼠逃脫時間長于Sham組(P＜0.05)。CCH+ Resveratrol白藜蘆醇預處理缺血組逃脫時間與CCH組相比顯著降低(P＜0.05)，但是與假手術組和白藜蘆醇組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CCH組大鼠突觸界面曲率、突觸活性區(qū)長度以PSD厚度顯著低于Sham組(P＜0.05)，且突觸間隙寬度顯著高于Sham組(P＜0.05)，白藜蘆醇處理后大鼠突觸界面參數(shù)恢復正常。CCH組大鼠樹突刺和蘑菇狀刺與Sham組相比顯著減少(P＜0.05)，CCH+Resveratrol組減少量明顯下降。在CCH組腦缺血大鼠中的PSD95、PSD93、NR2A/B三類蛋白水平顯著下降，而通過白藜蘆醇預處理可以部分改善這一現(xiàn)象。結論白藜蘆醇預處理的腦缺血大鼠在功能以及結構方面有效的恢復了其突觸可塑性，而突觸相關蛋白的表達在白藜蘆醇介導的腦缺血大鼠模型的神經(jīng)元保護作用中起到關鍵作用。

血管性癡呆；白藜蘆醇；突觸可塑性；樹突刺

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)之后在老年人群中又一比較常見的癡呆型疾病[1]。在全世界確診的癡呆病例中有約20%是血管型癡呆[2]。突觸的可塑性是指突觸的形態(tài)和功能可發(fā)生較為持久改變的特性或現(xiàn)象。突觸可塑性主要包括短期突觸可塑性(short-term synaptic plasticity，STSP)與長期突觸可塑性(long-term synaptic plasticity，LTSP)。短期突觸可塑性主要包括易化、抑制以及增強。長期突觸可塑性主要表現(xiàn)形式為長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)，這兩者已被公認為是學習及記憶活動的生物學基礎。大量的研究證明，癡呆型大鼠的突觸可塑性已被嚴重損害[3]。因此，保護突觸可塑性是治療記憶衰退行之有效的方法。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雙側頸總動脈結扎會引起大腦皮層和海馬體中神經(jīng)元的缺失和損害，進而影響大鼠的認知能力[4-5]。鑒于此，大鼠腦缺血模型(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)在血管性癡呆模型中廣泛使用[6]。

白藜蘆醇[(E)-3,5,4-三羥基二苯乙烯]是一種來源于葡萄、藍莓、草莓、桑葚等植物的芪類化合物，它是一種抗毒素，主要功能是防御細菌和真菌對植物的傷害[7]。已有研究證明，白藜蘆醇在增加壽命以及延緩衰老方面具有很多有益的作用[8]。在神經(jīng)系統(tǒng)當中，白藜蘆醇的保護機制已有廣泛研究。例如，白藜蘆醇抑制組蛋白去乙?；讣せ詈髮S突的損害，減弱體外蛋白激酶激活后所導致的多肽誘導性神經(jīng)元損傷效應，而且在線蟲和哺乳動物神經(jīng)元中可以緩解由于多聚谷氨酰胺所致的細胞毒性[9-10]。在沙鼠腦缺血性損傷模型試驗中，白藜蘆醇同樣可以降低由于非化學因素所導致的神經(jīng)元細胞死亡率，這樣的結果也可進一步說明白藜蘆醇在由于血管因素所引起的腦損傷中的保護作用。然而，在腦缺血大鼠模型試驗中，白藜蘆醇是否對突觸可塑性具有保護作用仍不清楚。

本研究通過白藜蘆醇預處理腦缺血大鼠，以大鼠空間辨識能力和記憶力、神經(jīng)元突觸界面參數(shù)、樹突刺形態(tài)學變化以及突觸相關蛋白的表達水平為指標，探究白藜蘆醇對腦缺血大鼠突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只雄性維斯塔(Wistar)大鼠[(200±10)g]購買自湖北省疾病預防與控制中心。所有動物試驗均依據(jù)“神經(jīng)系統(tǒng)科學研究中對動物及人類的使用政策”進行。實驗動物在實驗室適應性飼養(yǎng)一周后開始使用。按照數(shù)字隨機法將其隨機分為四組：對照組(Sham，n=15)，腦缺血大鼠模型組(CCH，n=15)，給予40 mg/kg白藜蘆醇預處理四周的腦缺血大鼠模型組(CCH+Resveratrol，n=15)以及白藜蘆醇處理組(Resveratrol，n=15，只通過白藜蘆醇預處理)。所有的大鼠置于22℃的聚丙烯籠子中，光照時間為8 am，均給予正常食物和水。

1.2 藥物和抗體 白藜蘆醇購買自Sigma-Aldrich公司并溶于二甲亞砜備用?？贵wpAb PSD95(1：1 000)、pAb PSD93(1：1 000)、Syp(1：1 000)、pAb NR2B(1：1 000)均購自Bioworld科技有限公司(St.Louis Park，MN)。羊抗兔多克隆免疫球蛋白G(IgG)(1：10 000)以及羊抗鼠IgG(1：10 000)均購自拜力生物科技有限公司。

1.3 腦缺血大鼠模型建立 將大鼠雙側頸動脈結扎，得到腦缺血大鼠模型。使用10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，使用電熱毯維持該大鼠體溫在(37.0±0.2)°C。將金屬線圈纏繞于雙側頸動脈，使其血流量保持在70%左右，控制整個過程在15 min之內(nèi)完成。外科手術4周過后，對大鼠進行行為檢測和生理生化指標檢測。

1.4 水迷宮檢測 水迷宮是一個直徑150 cm、高50 cm的循環(huán)池。分為四個虛擬象限(NW、NE、SW和SE)并裝滿約20℃的水。通過水迷宮檢測來考察動物的記憶能力。大鼠通過五周的訓練過后，依據(jù)池外所提供的線索在西南(SW)象限找到一個低于水面1～2 cm的平臺。在每次的實驗中，給予大鼠60 s時間來找到隱藏的平臺并使其在平臺上停留30 s。直到大鼠離開平臺實驗結束。如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，實驗員將其引導找到平臺，但是該實驗數(shù)據(jù)不需記錄。最終的結果包括20次實驗，4次/d，連續(xù)5 d。根據(jù)天數(shù)記錄實驗結果。通過游泳或潛水來找到平臺都需在實驗中記錄。

1.5 電鏡切片制作及突觸界面結構參數(shù)測量 將經(jīng)過多次漂洗組織塊，依次經(jīng)2%鋨酸固定2 h、磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次、乙醇逐級脫水(50%、70%、90%、100%)、Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(R型)切片，切片厚度約50 nm，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色。在透射電子顯微鏡(日本，日立，H7500)下放大20 000倍并隨機攝片，使用德國萊卡DM1000圖像分析軟件測量神經(jīng)元突觸的突觸界面曲率(參照Jones等[11]的方法)、突觸活性區(qū)長度與突觸后致密物厚度(PSD)(參考Guldner[12]方法)、突觸間隙寬度(用多點平均法測定)。

1.6 高爾基體染色法 將組織切片(約3 mm厚度)放入染色劑(5%水合氯醛、5%重鉻酸鉀、10%福爾馬林)3 d。將切片放入1%的硝酸銀中并真空保存4 d。使用振動切片機將腦組織切成厚度為50 μm的截面，用光學顯微鏡100倍物鏡進行分析，樹突刺的數(shù)量和蘑菇狀樹突所占的百分比。在每組實驗中，每個動物(n=4)至少分析40個細胞。

1.7 Western blot 在顯微鏡下將大腦半球取出，并將海馬體移出放入裂解液當中。勻漿后于10 000×g離心30 min，取上清進行蛋白免疫印跡實驗分析。通過二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)試劑盒提取蛋白后進行濃度測量，之后添加10%的β-巰基乙醇和0.05%溴酚藍，將混合物煮沸10 min。混合物中的蛋白質(zhì)通過10%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉移到硝化纖維膜。此硝化纖維膜使用5%的脫脂棉封閉后使用抗體(PSD95、PSD93、NR2B、Syp)4℃過夜培養(yǎng)。24 h后，將膜清洗3次，室溫二抗孵育2 h，使用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey Infrared Imaging System)取像以及柯達數(shù)字科學1D軟件進行蛋白定量分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 白藜蘆醇對腦缺血大鼠的記憶力與空間感知能力的影響 水迷宮檢測結果如圖1A所示，隨著測量次數(shù)的增多所有大鼠的逃脫時間都顯著下降，而且四組之間差異有統(tǒng)計學意義。從第三天開始，CCH組腦缺血大鼠的逃脫時間明顯長于Sham組大鼠(P＜0.05)。與CCH組相比，CCH+Resveratrol組大鼠的逃脫時間顯著降低(P＜0.05)，但是與Sham組和Resveratrol組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義。在實驗過程中大鼠的逃脫線路同樣做了記錄，發(fā)現(xiàn)Sham組的大鼠走直線并在20 s之內(nèi)完成逃脫，找到平臺，但是CCH組腦缺血大鼠至少需要40 s，其線路不是直線，而是隨機的曲線(如圖1B)。在整個實驗過程中，大鼠的游泳速度沒有明顯差異。

2.2 大鼠突觸界面結構變化 四組大鼠神經(jīng)元突觸界面結構參數(shù)測量結果如表1，CCH組大鼠突觸界面曲率、突觸活性區(qū)長度以PSD厚度顯著低于Sham組，且突觸間隙寬度顯著高于Sham組。CCH+ Resveratrol組及Resveratrol組的活性區(qū)長度及PSD厚度顯著高于CCH組(P＜0.05)，但與Sham組比較無顯著性變化(P＞0.05)；突觸間隙寬度顯著低于CCH組 (P＜0.05)。

2.3 齒狀回區(qū)樹突刺的形態(tài)學變化 高爾基體染色實驗結果如圖2所示。CCH組大鼠的樹突刺和蘑菇狀刺顯著減少(P＜0.05)，而CCH+Resveratrol組大鼠樹突刺減少量明顯(P＜0.05)。這些結果證明，白藜蘆醇的預處理可以改變樹突刺的形態(tài)。

2.4 白藜蘆醇對突觸相關蛋白表達的影響 通過Western blot檢測PSD95、PSD93、NR2A/B以及海馬體中的突觸小泡蛋白(synaptophysin，Syp)的水平，我們發(fā)現(xiàn)，在CCH組大鼠中的PSD95、PSD93、NR2A/B三類蛋白水平顯著下降，而通過白藜蘆醇預處理可以部分改善這一現(xiàn)象(圖3)。突觸小泡蛋白的變化在四組中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，因此我們推測白藜蘆醇所致的蛋白水平的變化可能發(fā)生在突觸前端。

圖1 水迷宮中大鼠的逃脫時間和線路統(tǒng)計

表1 四組大鼠突觸結構參數(shù)測量結果(±s)

表1 四組大鼠突觸結構參數(shù)測量結果(±s)

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與腦缺血組比較，P＜0.05。

組別Sham組CCH組CCH+Resveratrol組Resveratrol組F值P值例數(shù)10 10 10 10突觸界面曲率1.409 6±0.023 1 1.324 7±0.056 2a1.384 7±0.032 3 1.375 2±0.024 5 6.170 0.018活性區(qū)長度(nm) 378.92±18.67 243.57±15.43a354.62±21.47b346.97±16.72b7.610 0.010 PSD厚度(nm) 75.48±3.78 51.73±6.52a69.73±5.89b65.98±4.63b8.644 0.007突觸間隙寬度(nm) 19.17±1.89 25.65±1.57a21.43±1.17b18.96±1.73b10.23 0.004

圖2 樹突刺的形態(tài)學改變

圖3 海馬體中突觸相關蛋白的表達水平

3 討 論

白藜蘆醇對神經(jīng)的保護作用與大量的生理過程相關，如減少線粒體的功能紊亂、降低氧化性損傷以及慢性炎癥；改善血管功能；可以激活長時程增強基因如抗衰老酶的相關基因的表達。由于白藜蘆醇可以很好的解決腦血液的供應，而且其在大腦中的活性持續(xù)時間長達4 h，因此它被廣泛的使用在改善老年人記憶力的治療中[13-14]。白藜蘆醇通過激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在抑郁癥的治療中發(fā)揮重要作用[15]。有研究顯示白藜蘆醇可以抑制腦缺血大鼠空間感知能力以及記憶力的衰退[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCH+Resveratrol組大鼠在水迷宮中的停留時間顯著降低，且出逃路線也相對簡單，表明白藜蘆醇可以降低腦缺血對腦部認知功能的損傷。

本研究擴展了白藜蘆醇對腦缺血大鼠突觸不規(guī)則性的抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以改善腦缺血大鼠的突觸結構而且可以治療恢復腦缺血對大鼠其樹突刺的損害。樹突刺作為樹突能量的儲存場所，它可以將信號傳遞給神經(jīng)元細胞[17]。而樹突刺由包括復雜的具有特異性物質(zhì)組成，這些物質(zhì)可以形成復雜的信號通路，并在突觸前體中具有重要的作用，因此保護樹突刺對保護突觸可塑性具有重要作用。

本研究同樣證明，白藜蘆醇的治療可以增加PSD95、PSD93、NR2A/B的蛋白表達水平，但是對突觸小泡蛋白的表達無顯著性影響。說明白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)突觸前端蛋白水平的表達，修復腦缺血對突觸的損傷。突觸相關蛋白的表達與突觸的結構和功能密切相關，是突觸發(fā)揮信號傳導功能的重要標志。研究早已證實，白藜蘆醇能增強大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生，改善認知功能障礙，增加神經(jīng)細胞之間形成的突觸聯(lián)系增多[18-19]。本研究結果也表明，白藜蘆醇可以通過上調(diào)PSD95、PSD93、NR2A/B的表達促進腦缺血大鼠神經(jīng)突觸的重塑。

突觸可塑性是指突觸結構在形態(tài)學上以及功能上的修飾作用，表現(xiàn)為在突觸在一定條件下調(diào)整功能的調(diào)整、形態(tài)的改變形態(tài)和數(shù)目的增減增減數(shù)目的能力，包括突觸結構的改變以及突觸信號轉導轉到能力的改變[20]。本研究選取與突觸形態(tài)結構和功能緊密相關的突觸結構參數(shù)以及突觸調(diào)節(jié)蛋白Syp、PSD95、PSD93和NR2A/B為觀察指標，證實了白藜蘆醇治療可以修復腦缺血大鼠模型的突觸損傷，增強突觸可塑性。白藜蘆醇治療后腦缺血大鼠模型突觸活性區(qū)長度和PSD厚度恢復正常值，表明白藜蘆醇可以提高突觸連接區(qū)面積，促進突觸前后距離的縮短，提高信息傳遞效率，且PSD95、PSD93和NR2A/B的上調(diào)表達也在蛋白水平證實白藜蘆醇的作用機制?？傊?，本研究證明了在腦缺血大鼠模型中白藜蘆醇的潛在作用機制以及療效，為血管性癡呆治療提供了基礎性的實驗證據(jù)。

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Effect of resveratrol on synaptic plasticity in cerebral ischemic rats.

LI Hua-gang,RAO Yan,NIE Hua.Department of Neurology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigated the influence of resveratrol on synaptic plasticity in cerebral ischemic rats.MethodsSixty male Wistar rats were randomly divided into 4 groups:a sham group(sham,n=15),a chronic cerebral hypoperfusion group(CCH,n=15),a CCH with resveratrol pretreatment for 4 weeks(CCH+resveratrol,n=15)and resveratrol administration group(resveratrol,n=15).The Morris water maze(MWM)test was used to assess the spatial memory of rats;transmission electron microscopy(SEM)was used to measure the neuron synaptic interface structure parameters;the morphological changes of synapse by detecting dendritic spines in the dentate gyrus region was detected by Golgi staining;the expression levels of synaptic-related proteins were detected by Western blot.ResultsCompared to the sham group,the escape latency of CCH group was increased significantly(P＜0.05).And the escape latency of the CCH+resveratrol group was significantly lower than the CCH group(P＜0.05),but there was no significant difference compared to the sham group and the resveratrol group(P＞0.05).Compared to the sham group,the curvature of synaptic interface,synaptic active area length and PSD were decreased significantly and the synaptic cleft width was significantly increased in CCH group(P＜0.05),while synaptic interface parameters in rats returned to normal after the rats were pretreated with resveratrol.The density of dendritic spine and the percentage of mushroom-type spines in the CCH group were decreased compared to the sham group(P＜0.05),but pre-administration with resveratrol strongly improved the inhibited spinogenesis.Compared to Sham group,the protein levels of PSD95,NR2A/B,and PSD93 were significantly decreased in the CCH group,which was partially improved by pre-administration with resveratrol.ConclusionResveratrol pre-application recovery the synaptic plasticity in the aspect of functional and structural in cerebral ischemia rats,and the expression levels of Synaptic synaptic related protein play a key role in the protection of neurons in rat model of resveratrol-mediated cerebral ischemia.

Vascular dementia;Resveratrol;Synaptic plasticity;Dendritic spine

R-332

A

1003—6350（2017）03—0348—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.002

2016-09-29)

李華鋼。E-mail：lihg0909@sina.com