徐志波 陳芳 江勁

COPD營養(yǎng)不良大鼠下丘腦瘦素受體活化后STAT3、SOCS3的表達研究

徐志波 陳芳 江勁

目的 通過檢測慢性阻塞性肺疾?。–OPD）合并營養(yǎng)不良大鼠血清瘦素及其下丘腦受體活化后信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3（SOCS3）的表達，推測其在介導(dǎo)類似于惡病質(zhì)的COPD營養(yǎng)不良出現(xiàn)的可能機制。方法 將30只SD大鼠分為兩組：正常組、COPD組各15只。兩組大鼠在自制熏煙箱內(nèi)被動吸煙24周，并在第30、45天于氣道內(nèi)滴入脂多糖（LPS）0．2ml。觀察各組大鼠的一般情況，檢測血清瘦素、TG、低密度脂蛋白（VLDL）水平，制作肺組織HE病理切片，Western-blot法測定下丘腦STAT3、SOCS3相對表達量。 結(jié)果 COPD組大鼠肺細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長均較正常組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7．633、18．843、8．470，均P＜0．01），COPD組體重、TG、VLDL、瘦素、SOCS3的表達均低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8．199、-16．736、-4．043、-6．235、-8．738，均P＜0．01），而STAT3表達水平則高于正常組（t=18．860，P＜0．01）。結(jié)論COPD大鼠合并營養(yǎng)不良的出現(xiàn)，可能與瘦素作用于下丘腦受體后引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT3表達上調(diào)和SOCS3表達下調(diào)有關(guān)。

瘦素 慢性阻塞性肺疾病 營養(yǎng)不良 信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子3 細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統(tǒng)的常見慢性疾病，病情反復(fù)、遷延發(fā)展過程中往往會合并營養(yǎng)不良，導(dǎo)致患者在COPD終末期出現(xiàn)類似惡病質(zhì)的情況。雖其發(fā)生機制是多方面的，但眾多研究表明，瘦素在介導(dǎo)COPD合并營養(yǎng)不良的發(fā)生、發(fā)展中具有不可忽視的作用。鑒于有關(guān)瘦素作用于下丘腦受體后信號分子的變化文獻報道較少，筆者對COPD合并營養(yǎng)不良大鼠血清瘦素水平及下丘腦受體活化后信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3（SOCS3）表達的變化進行了研究，從而推測其在介導(dǎo)類似于惡病質(zhì)的COPD營養(yǎng)不良中的可能機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 成年清潔級SD大鼠30只，均為雄性，體重（217±13）g；由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，每籠5只，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，控制室溫（20±2）℃，濕度40%～70%，12h交替采光，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。實驗用煙為雄獅牌過濾嘴香煙（浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品，焦油量8mg，煙氣煙堿量0.7mg）。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，瘦素、TG、低密度脂蛋白（VLDL）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購自武漢新啟迪生物科技有限公司?？筍TAT3抗體（anti-STAT3 antibody）試劑盒購于美國Santa Cruz公司，批號：A7224?？筍OCS3抗體（anti-SOCS3 antibody）試劑盒購于美國Santa Cruz公司，批號：Sc-9023。甲醇、水合氯醛等常規(guī)試劑購置于華東醫(yī)藥集團有限公司。自制熏煙機為浙江平湖宏利公司生產(chǎn)；AllegraX-15R大容量離心機購于美國貝克公司；超凈工作臺購于蘇州安泰有限公司；酶標(biāo)儀購于芬蘭Thermo公司；酶標(biāo)儀分析軟件購于芬蘭Thermo公司；蛋白紫外分光光度計購于德國Eppendorf公司；Mini-PROTEAN電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；定量PCR儀器購于美國ABI公司；CO煙霧濃度監(jiān)測儀購于英思科傳感儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模方法 30只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分成正常組、COPD組各15只。采用和改進宋一平等[1]的造模方法，COPD組大鼠每天在自制熏煙機里吸煙2h（上、下午各1h），維持煙箱內(nèi)煙霧濃度450～500bPm。在造模第30、45天分別予COPD組大鼠氣道滴入LPS 0.2ml，滴入LPS當(dāng)天不吸煙，共吸煙24周。正常組與COPD組飼養(yǎng)環(huán)境相同，但不吸煙。最后以肺組織病理切片所見作為COPD造模成功的金標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)Congleton的研究[2]，筆者在造模過程中，每周2次固定時間動態(tài)監(jiān)測大鼠體重，以COPD組低于正常組90%的體重為營養(yǎng)不良的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 標(biāo)本采集 大鼠吸煙24周，常規(guī)稱重后予10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔內(nèi)注射麻醉，腹主動脈取血5ml，置于預(yù)冷的負壓真空采血管中，靜置30min后，于離心機中以2 000r/min，4℃離心10min，收集上清液分裝至-70℃冰箱中保存；大鼠處死后開胸分離肺組織，迅速于10%中性甲醛溶液中固定。并按照張殿全等[3]方法，在枕骨大孔處迅速剪斷延髓，去顱骨，完全暴露腦組織，取出腦組織，在冰冷平皿上去大腦、小腦，分離出下丘腦后在冰冷生理鹽水中洗去殘留血液，置于無菌凍存管后迅速放入液氮罐中凍存。

1.2.3 肺組織病理檢查 將在甲醛溶液中固定24h的肺組織，常規(guī)取材脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，中性樹膠封片。在顯微鏡100倍視野下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化，包括炎癥細胞浸潤、管壁纖維增生程度及管腔變形狹窄程度，計算其管壁厚度、管壁面積、管壁周長及管壁面積/管壁周長比值。

1.2.4 大鼠血清瘦素、TG、VLDL的測定 取出冷凍的血標(biāo)本常溫解凍后，于超凈臺上采用ELISA法測定兩組血清瘦素、TG、VLDL水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 下丘腦STAT3、SOCS3測定 采用Wester-blot法將分離的下丘腦解凍后進行總蛋白的提取和定量，SDS-PAGE電泳分析、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、轉(zhuǎn)印膜和封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影及定影等步驟。具體要求依據(jù)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)及試劑盒說明書操作。最后采用Bandscan 5.0軟件分析條帶的光密度值，每個條帶重復(fù)3次，目的蛋白相對表達量=目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參β-actin（光密度值），再乘以系數(shù)進行校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，其中管壁厚度、管壁面積、管壁面積/管壁周長比值均采用e為底的對數(shù)進行校正。組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肺組織病理檢查所見及支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長比較 見圖1、表1。

圖1 兩組大鼠肺組織病理檢查所見（a:正常組，b:COPD組；HE染色，×100）

表1 兩組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長比較

由圖1可見，正常組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡間隔清晰，氣道管壁無纖維增生，管腔無變形狹窄，內(nèi)無黏液附著，基本無炎癥細胞浸潤；而COPD組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯破壞，氣道管壁纖維增生，管腔嚴重變形狹窄，大量黏液阻塞管腔，炎癥細胞彌漫浸潤。

由表1可見，COPD組大鼠肺細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長均較正常組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.633、18.843、8.470，均P＜0.01）。

2.2 兩組大鼠體重變化及血清瘦素、TG和VLDL水平比較 見圖2、表2。

圖2 兩組大鼠體重變化的比較

表2 兩組大鼠體重及瘦素、TG、VLDL表達水平的比較

由圖2、表2可見，從第4周開始，COPD組體重增速即開始較正常組減慢。至第24周，COPD組體重較正常組下降約14.3%，COPD組體重低于正常組90%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.199，P＜0.01）。而COPD組大鼠血清瘦素、TG、VLDL表達水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.235、-16.736、-4.043，均P＜0.01）。

2.3 兩組大鼠下丘腦STAT3、SOCS3相對表達量比較 見圖3。

由圖3可見，COPD組STAT3相對表達量（31.96± 1.94），高于正常組（19.38±1.57），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.860，P＜0.01），COPD組SOCS3相對表達量（18.20± 0.78），低于正常組（23.04±1.92），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.738，P＜0.01）。

圖3 兩組大鼠下丘腦STAT3、SOCS3測定的電泳圖

3 討論

COPD營養(yǎng)不良動物模型是否成功建立對本研究至關(guān)重要。目前建立COPD模型國外大多使用清潔級BN大鼠來復(fù)制動物模型。而我國主要使用清潔級Wistar或SD大鼠制作COPD動物模型。故鑒于目前尚無一種被公認的建立最佳COPD動物模型的大鼠類型和方法，本研究通過大量的文獻檢索及前期預(yù)實驗，決定采用和改進宋一平等的造模方法分2次氣管內(nèi)注入適量LPS和反復(fù)熏香煙煙霧的方法構(gòu)建COPD大鼠模型，因其病理生理改變與人類COPD疾病形成狀態(tài)相似，加之氣道滴入LPS模擬人類肺部感染。本實驗采用煙熏加氣管滴注LPS的方法復(fù)制模型，模擬人類COPD疾病的發(fā)病模式。通過對動物的一般情況及肺組織病理切片的觀察比較發(fā)現(xiàn)：經(jīng)煙熏的SD大鼠逐漸出現(xiàn)煩躁，明顯嗆咳，呼吸急促，連續(xù)煙熏后癥狀逐漸加重；肺組織HE染色顯示細支氣管管腔變形、中層膠原纖維增生，平滑肌明顯增厚，管腔明顯狹窄，管腔內(nèi)可見脫落上皮細胞及大量黏液，黏膜上皮增厚，黏膜皺壁有的形成假腺體樣結(jié)構(gòu)向管腔內(nèi)突起，基底膜增厚，黏膜、黏膜下層有大量的炎癥細胞浸潤，肺泡隔破壞、增厚，肺泡腔變小，甚至部分細支氣管管腔閉塞。最終引起大鼠氣道的重塑，造模24周后，COPD組大鼠肺小氣道均不同程度出現(xiàn)炎性細胞浸潤、管壁增厚、管腔狹窄，提示COPD大鼠模型復(fù)制成功。同時每周2次固定時間動態(tài)監(jiān)測并比較兩組體重變化，實驗數(shù)據(jù)顯示COPD組大鼠在煙熏第24周出現(xiàn)體重較正常組下降14.3%，COPD大鼠體重低于正常組大鼠90%以上，參照Congleton的研究，說明本實驗建立的COPD營養(yǎng)不良大鼠模型是成功的。

瘦素由肥胖基因編碼，主要是由脂肪組織分泌的一種N端帶有21個氨基酸信號肽的多肽，其主要功能是調(diào)節(jié)機體的能量代謝及脂肪的合成，是目前肯定的與COPD有明顯相關(guān)性的細胞因子之一。Karakas等[4]在研究COPD穩(wěn)定期患者循環(huán)瘦素水平與身體組成的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，COPD患者的瘦素水平低于健康對照者，且隨著BMI的下降，瘦素水平進一步降低。瘦素主要通過與下丘腦瘦素受體結(jié)合，而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，受體活化后信號傳導(dǎo)是其功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，酪氨酸激酶2（JAK2）/ STAT3途徑是瘦素作用于下丘腦瘦素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，而在此通路上STAT3、SOCS3的作用是不可忽視的。STAT3活化并轉(zhuǎn)移定位到細胞核，與特定基因啟動子區(qū)域的DNA元件或其他的轉(zhuǎn)錄因子或附屬蛋白相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制神經(jīng)肽的分泌，從而抑制食欲、減少攝食以及增加能量的輸出[5-6]。SOCS3是由瘦素介導(dǎo)STAT3活化并進入核內(nèi)，特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生的，其作用可通過負反饋來抑制激活的JAK/STAT3信號途徑[7]，從而減輕患者的厭食效應(yīng)?？傊?，瘦素通過作用于下丘腦受體從而激活JAK2/STAT3通路，一方面增加STAT3的表達達到抑制食欲，同時另一方面又在持續(xù)誘導(dǎo)或激活SOCS3的表達來對STAT3的作用進行負反饋抑制。正常狀態(tài)下，它們的相互作用處于動態(tài)平衡中。

本實驗結(jié)果顯示，COPD組合并營養(yǎng)不良大鼠下丘腦STAT3表達較正常組明顯增多，另一方面COPD組合并營養(yǎng)不良大鼠SOCS3表達較正常組明顯增少，且均有統(tǒng)計學(xué)意義，同時結(jié)合COPD組營養(yǎng)不良大鼠瘦素及體重檢測結(jié)果，也較正常組均降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果提示，COPD組營養(yǎng)不良大鼠體重持續(xù)降低與瘦素有重要關(guān)系，其作用機制可能與瘦素作用于下丘腦受體后引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT3表達上調(diào)和SOCS3表達下調(diào)有關(guān)。COPD合并營養(yǎng)不良大鼠瘦素表達減少，下丘腦STAT3表達增加、SOCS3表達減少，3者作用動態(tài)失衡，可能是導(dǎo)致COPD大鼠類似于惡病質(zhì)的營養(yǎng)不良出現(xiàn)的重要原因之一。

[1] 宋一平,崔德建,茅培英．慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J]．軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報,2001,22(2):99-102．

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[3]張殿全,孫忠人．針刺四神聰對失眠大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5HIAA含量的影響[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(9):1975-1977．

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Expression of STAT3 and SOCS3 following leptin receptor activation in hypothalamus in COPD rats with malnutrition

Objective To investigate the expression of STAT3 and SOCS3 following leptin receptor activation in hypothalamus in COPD rats with malnutrition state．MethodsThirty SD rats were randomly divided into control group and COPD group with 15 in each group．Rats in COPD group received passive smoking for 24 weeks,then LPS 0．2ml was dripped in the airway at d30 and d45．All animals were sacrificed after experiments;serum leptin,triglycerides,VLDL were measured;and pathological examination of lung tissue was performed;relative expression of STAT3 and SOCS3 in hypothalamus was detected by Western-Blot．Results The body weight,and triglycerides,VLDL,leptin levels,and the expression of SOCS3 in COPD group were lower than those in normal group(all P＜0．01),while the expression of STAT3 was higher(P＜0．01)． Conclusion The malnutrition state in COPD rats may be related to the leptin-mediated up-regulation of STAT3 expression and down-regulation of SOCS3 expression in hyothalamus．

Leptin COPD Malnutrition STAT3 SOCS3

2016-05-28）

（本文編輯：馬雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-790

國家自然基金項目（2012R10063）；浙江省衛(wèi)生廳一般項目（2013KYA140）；浙江省博士后科研資助項目（BSH1402070）

310005 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（徐志波、江勁）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺功能室（陳芳）

陳芳，E-mail：funchen@163.com