金劼 彭政 何援軍 姜聰嬌 黃百洋 杜曉英

慢性腎功能衰竭患者線粒體基因組D-loop區(qū)突變研究

金劼 彭政 何援軍 姜聰嬌 黃百洋 杜曉英

目的 通過(guò)研究慢性腎功能衰竭（CRF）患者及家系成員中線粒體D-loop區(qū)的基因變異情況，探討其與CRF發(fā)病之間可能的聯(lián)系。方法 收集42例CRF患者（CRF組）和95名家系成員（UAPM組），以及隨機(jī)選取的122例正常人（對(duì)照組）的外周血，提取線粒體DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增D-loop區(qū)并對(duì)產(chǎn)物純化，然后進(jìn)行基因測(cè)序來(lái)檢測(cè)線粒體基因組D-Loop區(qū)域基因變異情況,并進(jìn)行比較，分析該區(qū)域基因變異與CRF發(fā)病的可能相關(guān)性。 結(jié)果 通過(guò)與對(duì)照組及標(biāo)準(zhǔn)序列比較，共發(fā)現(xiàn)79個(gè)核苷酸改變，3個(gè)高頻變異位點(diǎn)，其中總的堿基突變率在CRF組及UAPM組明顯增加，兩組與對(duì)照組堿基變異率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．01）。CRF組及UAPM組在D310區(qū)線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定（mtMSl）及堿基變異率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．01）。結(jié)論線粒體基因組D-Loop區(qū)突變可能與CRF的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系。

線粒體DNA D-loop 慢性腎功能衰竭 微衛(wèi)星不穩(wěn)定 突變

有關(guān)慢性腎功能衰竭（CRF）的發(fā)病機(jī)制報(bào)道較多，但有關(guān)自由基與CRF的相關(guān)研究較少。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來(lái)源和靶位，也是細(xì)胞凋亡的主開(kāi)關(guān)，線粒體的功能狀態(tài)決定細(xì)胞的生死存亡。腎臟作為人體能量需求較大的器官之一，線粒體功能障礙將導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)功能缺陷的線粒體產(chǎn)生的活性氧增加，會(huì)加重腎臟的氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激可直接損傷線粒體DNA（mtDNA），使mtDNA易發(fā)生突變[1]。mtDNA多態(tài)性熱點(diǎn)區(qū)域主要位于包括D-loop在內(nèi)的非編碼區(qū)域[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)CRF患者及家系成員的mtDNA D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性，并與正常人進(jìn)行對(duì)比，觀察mtDNA的突變與CRF發(fā)病的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2012年3月至2013年8月在浙江衢化醫(yī)院診斷為慢性腎臟?。–KD）并有完整隨訪資料的CRF患者42例（CRF組）及腎功能正常的家系成員（UAPM）95名（UAPM組）的資料和外周血標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn)：按2002年美國(guó)腎臟基金會(huì)“腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議”（KDOQI）指南診斷為CRF的患者；籍貫為浙江??；患者均為初診CRF且之前未接受透析、腎移植以及其他生物學(xué)治療。CKD的診斷參照2002年KDOQI指南[3]。另選取2008年12月至2009年3月于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心122例漢族人的資料和外周血標(biāo)本作為對(duì)照組[4]，從血液中提取線粒體DNA并測(cè)序進(jìn)行組間對(duì)照。3組一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料的比較

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 收集受試對(duì)象外周血5～10ml，置于-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。DNA提取采用Blood Genomic/Mitochondrial DNA Extraction Kit（美國(guó)杰美基因有限公司GenMed全血基因組/線粒體DNA同步萃取試劑盒），按照說(shuō)明書(shū)對(duì)凍存外周血同時(shí)提取線粒體DNA和基因組DNA。通過(guò)化學(xué)溶解純化血白細(xì)胞、物理或化學(xué)破膜及離心處理方法，從全血樣品中分離出完整而純化的細(xì)胞核和線粒體細(xì)胞器，然后進(jìn)一步用生物酶處理分別獲得高質(zhì)量的基因組和線粒體DNA。提取的DNA在紫外分光光密度儀上進(jìn)行定量，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 線粒體DNA D-loop PCR分析 在網(wǎng)絡(luò) mitomap.org查詢?nèi)薽tDNA的劍橋序列（GenBank#J01405.0 gi:337188），mtDNA的D-loop區(qū)位于1～576和16024～16569。用于擴(kuò)增mtDNA D-loop及鄰近編碼區(qū)引物：R: 5′-GAA TCG GAG GAC AAC CAG TA-3′S:5′-TGA TGT GAG CCC GTC TAA AC-3′，引物的合成與純化由上?；悼萍脊就瓿?。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性35s，62.5℃復(fù)性35s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓和60mA下60 min。凝膠成像儀上觀察、記錄、拍照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，有目的條帶出現(xiàn)后，進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)用ABI PRISM BigDyeTM循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒（德國(guó)Weiterstadt公司），在ABI Prism377測(cè)序儀（美國(guó)PE公司）上進(jìn)行，測(cè)序反應(yīng)用的引物同PCR反應(yīng)的引物。對(duì)已擴(kuò)增并純化的42例CRF標(biāo)本，95例UAPM標(biāo)本，122例對(duì)照組標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定工作主要由北京六合華大基因科技股份有限公司上海測(cè)序部完成。測(cè)序結(jié)果用CodonCodeAligner2.0.6軟件對(duì)峰圖的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)序峰圖質(zhì)量低的標(biāo)本安排重新測(cè)序?？捎玫臏y(cè)序結(jié)果以修正后的劍橋序列（rCRs）作為參考序列，用基于phred/phrap/consed序列拼接程序的 Windows圖形界面處理軟件包 CodonCodeAligner2.0.6進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分析時(shí)，利用CodonCode Aligner軟件中的Assemble和Findmutations功能，將所有需要比對(duì)的序列進(jìn)行拼接和比對(duì)，同時(shí)與參考序列比對(duì)，以查找突變和分析SNP位點(diǎn)。最后以Chromas軟件來(lái)觀察具體的峰圖形狀以確定是否確有突變發(fā)生（修正后的rCRs來(lái)源于線粒體基因組數(shù)據(jù)www.Mitomap.org,gi號(hào)為 AC_000021.2，序列拼接分析所用軟件 Codon-CodeAligner2.0.6,下載地址 http://www.Codoneode.corn/ aligner/download.htm）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 3組變異性分析 CRF組、UAPM組和對(duì)照組中總堿基突變數(shù)分別為412、760和832，在79個(gè)變異位點(diǎn)中，91.1%（72/79）是同質(zhì)性突變，8.9%（7/79）為異質(zhì)性突變。其中有存在3個(gè)高頻變異位點(diǎn)分別是np73A-G, np263A-G和D310。其中CRF組42例及UAPM組95例均存在np73A-G和np263A-G突變，對(duì)照組分別存在108例np73A-G和105例np263A-G突變[4]，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，除了D310外，其他單個(gè)變異位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組堿基變異率比較 堿基變異率（變異堿基總數(shù)/所測(cè)堿基總數(shù)×100%）CRF組 0.88%[412/（42× 1120）]，UAPM組0.71%[760/（95×1120）]，對(duì)照組0.61% [832/（122×1120）]，CRF、UAPM組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.071、10.209，均P＜0.01）。

2.3 D310區(qū)的線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定（mtMSl）及堿基變異率分析 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，對(duì)所有標(biāo)本的D310區(qū)進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSl）分析顯示，CRF組、UAPM組共有119例存在MSI，CRF組、UAPM組與對(duì)照組變異頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.076、18.217，均P＜0.01）；CRF組、UAPM組與對(duì)照組堿基變異率比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=106.078、61.691，均P＜0.01）。

表2 D310區(qū)的mtMSl及堿基變異率統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

線粒體是細(xì)胞有氧代謝和生成活性氧的關(guān)鍵場(chǎng)所。細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)諸多抗氧化系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)活性氧的生成，從而維持正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡。線粒體活性氧穩(wěn)定狀態(tài)的打破，成為機(jī)體產(chǎn)生疾病和引發(fā)衰老的重要因素。當(dāng)產(chǎn)生和清除活性氧的平衡被打破，即出現(xiàn)氧化應(yīng)激時(shí)，mtDNA易受氧化損傷，mtDNA突變亦大大增加，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙，當(dāng)線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP障礙時(shí)，可釋放高水平的活性氧，從而進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡及對(duì)核基因組的損傷[5-6]。

在mtDNA突變與慢性腎臟疾病的研究方面，有學(xué)者研究了存在mtDNA4696bp缺失突變的小鼠模型早期即發(fā)生局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎（FSGS），并在6月齡時(shí)死于終末期腎功能衰竭，且在受損器官中腎組織mtDNA突變蓄積最為顯著[7]；Doleris等[8]報(bào)道了FSGS與線粒體功能障礙具有相關(guān)性；張勝雷等[9]認(rèn)為D-loop區(qū)的突變可能會(huì)導(dǎo)致mtDNA復(fù)制和基因表達(dá)異常，引起線粒體功能異常和氧化應(yīng)激的發(fā)生，最終導(dǎo)致包括CKD在內(nèi)的各種慢性疾病的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)mtDNA的D-loop區(qū)多態(tài)性與CKD患者腎臟生存預(yù)后有一定關(guān)聯(lián)性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CRF和UAPM組中，總堿基突變率在CRF患者及家系成員中明顯增加，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的堿基變異率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明隨著變異的增多，患CRF的風(fēng)險(xiǎn)可能增大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)高頻變異位點(diǎn)分別是np73A-G，np263A-G和D310。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，除了D310外，其他單個(gè)變異位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)它們可能為多態(tài)性改變，這也與張幼芳[10]的研究結(jié)果相一致。

D-loop區(qū)303～315（D310）單核苷重復(fù)性位點(diǎn)（C-stretch）更易被氧化磷酸化損傷和親電子攻擊，因而也成為mtDNA突變的研究熱點(diǎn)，D310的C-stretch也是最多發(fā)現(xiàn)線粒體微衛(wèi)星多態(tài)性的區(qū)域。對(duì)所有標(biāo)本的D310區(qū)進(jìn)行MSl分析顯示，實(shí)驗(yàn)組中分別有42例和77例存在MSI，與對(duì)照組比較，D310區(qū)發(fā)生MSI的頻率及堿基變異率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該區(qū)與對(duì)照組比較，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在患有CRF的患者及家系成員與正常人相比，MSI增加。

有學(xué)者觀察到mtDNA的突變經(jīng)常發(fā)生在D310附近,而這個(gè)區(qū)域負(fù)責(zé)RNA-DNA的形成,從而開(kāi)始mtDNA的復(fù)制[11]，因此一旦發(fā)生不穩(wěn)定將影響其功能的發(fā)揮。另外，由于D-Loop區(qū)是編碼蛋白質(zhì)的控制區(qū), mtDNA D-Loop區(qū)128～599片段包含了其H鏈上控制mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的大部分區(qū)域,尤其是mtDNA的突變熱點(diǎn)區(qū)D310的C-stretch位于這一區(qū)域內(nèi),在該區(qū)域的位點(diǎn)突變可能增加了慢性腎功能衰竭的發(fā)病易感性和疾病發(fā)展進(jìn)度。

線粒體DNA D-Loop區(qū)突變與CRF的發(fā)生、發(fā)展可能存在直接的相關(guān)性,但這些研究結(jié)果均有待進(jìn)一步增加樣本數(shù)來(lái)證實(shí)，同時(shí)其具體的分子作用機(jī)制也有待將來(lái)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Mutations of mitochondrial DNA D-loop region in patients with chronic renal failure

Objective To investigate the sequence variations of mitochondrial D-loop region in chronic renal failure patients and family members．MethodsForty two patients with chronic renal failure(CRF group)and 95 unaffected pedigree members(UAPM group)were recruited in the study,and 122 healthy subjects served as normal controls(NC group)．Mitochondrial DNA(mtDNA)was extracted from peripheral blood and the D-loop sequence variations were examined by PCR-based assay．The association between D-Loop gene variations and chronic renal failure was analyzed． Results Compared with normal control,79 sequence variants were detected,mtDNA exhibited a high rate of sequence variants in patients with CRF and pedigree members．Among these,three high variations were found and base variation rate in CRF and UAPM groups were significantly higher than that in normal control group(P＜0．01)．The occurrence of mtMSI at D310 in CRF and UAPM groups were higher than that in normal control group(P＜0．01)．Conclusion Genome mutations in mitochondrial D-Loop may be relate to the development of chronic renal failure．

Mitochondrial DNA D-loop Chronic renal failure Microsatellite instability Mutation

2016-01-19）

（本文編輯：馬雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2015-1374

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYA181）；衢州市科技局項(xiàng)目（20121083）

324004 衢州，浙江衢化醫(yī)院腎內(nèi)科（金劼、何援軍、姜聰嬌、黃百洋、杜曉英）；衢州市人民醫(yī)院腫瘤科（彭政）

金劼，Email：jingjie1@medmail.com.cn