章小鈴 王留強(qiáng) 孫 佩 吳立栓 樊 瑋 張 進(jìn) 盧孟柱 胡建軍

(1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091； 2. 中國科學(xué)院植物研究所光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100093)

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楊樹不同種質(zhì)花粉萌發(fā)和致敏蛋白的差異*

章小鈴1王留強(qiáng)1孫 佩1吳立栓2樊 瑋1張 進(jìn)1盧孟柱1胡建軍1

(1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091； 2. 中國科學(xué)院植物研究所光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100093)

【目的】 研究6份楊樹種質(zhì)(36號楊、南楊、110楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊)成熟花粉的萌發(fā)特性以及致敏蛋白差異，為低致敏楊樹品種選育及植物過敏性疾病控制等研究提供理論依據(jù)。【方法】 2015 年3月，在北京、河北和河南采集6份不同楊樹種質(zhì)的花枝，經(jīng)水培后收集花粉，采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行楊樹花粉萌發(fā)試驗(yàn)，并通過雙向電泳、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等研究不同楊樹種質(zhì)的花粉致敏蛋白差異。【結(jié)果】 1) 在6份楊樹種質(zhì)花粉中，36號楊、南楊和鉆天楊花粉活力較高，其次為110楊和小葉楊，森海2號楊活力最差； 24 h時(shí)花粉萌發(fā)率最大的種質(zhì)是36號楊，高達(dá)74.42%(±2.36%)，而三倍體森海2號楊花粉萌發(fā)率為0； 鉆天楊花粉管平均長度為456.00 μm(±2.05 μm)，小葉楊花粉管最短，為276.44 μm(±11.08 μm)，且不同種質(zhì)的花粉萌發(fā)率和花粉管萌發(fā)長度差異極顯著(P<0.01)，表明不同種質(zhì)的花粉活力存在很大差異。2) 利用Imagemaster 2D platinum 6.0軟件分析南楊、110楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊的2-DE圖譜，共發(fā)現(xiàn)有408個(gè)蛋白點(diǎn)相匹配，以36號楊鑒定的28個(gè)潛在致敏蛋白為參照，在5份種質(zhì)花粉中有6個(gè)致敏蛋白均缺失表達(dá)，南楊和森海2號楊花粉有21個(gè)致敏蛋白，110楊次之，有19個(gè)，而小葉楊和鉆天楊的致敏蛋白數(shù)量最少，為18個(gè)。對其余22個(gè)致敏蛋白進(jìn)行差異表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，其中有12個(gè)致敏蛋白在5份楊樹種質(zhì)中均低于36號楊，其相對表達(dá)量范圍為-3.99～-0.02，尤其是森海2號楊和小葉楊分別有10個(gè)和8個(gè)致敏蛋白表達(dá)量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于36號楊； 南楊和鉆天楊降低趨勢最小。有3個(gè)致敏蛋白在5份種質(zhì)中表達(dá)均高于36號楊，其中南楊最高，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，其次為鉆天楊、森海2號楊和110楊、小葉楊。組間差異方差分析發(fā)現(xiàn)南楊和鉆天楊的17個(gè)致敏蛋白表達(dá)量顯著或極顯著大于小葉楊和森海2號楊。3) qRT-PCR分析結(jié)果表明，9個(gè)致敏蛋白編碼基因中有5個(gè)在南楊和鉆天楊中表達(dá)量都較高，包括spots 12、51、200、216和161，其次是小葉楊，而森海2號楊和110楊均只有2個(gè)致敏基因表達(dá)高?！窘Y(jié)論】 楊樹不同種質(zhì)間花粉活力、致敏蛋白數(shù)量以及表達(dá)量存在明顯差異，可為今后楊樹低致敏新品種選育提供重要的參考，但是成熟花粉致敏蛋白表達(dá)量的高低與其致敏性強(qiáng)弱的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。

楊樹； 成熟花粉； 致敏蛋白； 雙向電泳； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

近年來，過敏性疾病已經(jīng)成為許多國家和地區(qū)季節(jié)性的流行病(呂相征等， 2005)，受到社會各界的廣泛關(guān)注，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一。在眾多的過敏原之中，花粉是自然界中最常見的吸入型過敏原，容易造成過敏患者出現(xiàn)支氣管哮喘、季節(jié)性鼻炎、枯草熱及皮炎等癥狀(陳紹寧等， 2008)。新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，幾乎所有工業(yè)化國家的花粉過敏病人口都在劇增，例如美國、日本、意大利、西班牙、奧地利等國家花粉過敏癥的人數(shù)占總?cè)丝诘?5%左右，而挪威、瑞典、比利時(shí)、英國和法國花粉過敏患者高達(dá)30%左右。在我國，花粉過敏的發(fā)病率為0.5%～1%，高發(fā)病區(qū)達(dá)5%，雖然沒有上述一些國家那么嚴(yán)重，但近年來發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年增高趨勢(楊瓊梁等， 2015)。

木本植物花粉過敏現(xiàn)象在許多國家都有報(bào)道，花粉飄散具有明顯的季節(jié)性和地域性，不同國家和地區(qū)在不同季節(jié)有不同的致敏花粉。Lin等(2002)調(diào)查了引起花粉過敏癥主要的過敏原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起過敏(患病率)的花粉樹種主要是美國白櫟(Quercusalba)(34.3%)、垂枝樺(Betulapendula)(32.9%)和梣葉槭(Acernegundo)(32.9%)，其次為山毛櫸(Fagusgrandifolia)(29.6%)、美國白梣(Fraxinusamericana)(26.0%)、美國榆(Ulmusamericana)(24.6%)和美洲黑楊(Populusdeltoides)(20.6%)。根據(jù)土耳其錫夫里希薩爾氣傳致敏花粉濃度的調(diào)查結(jié)果顯示，松科(Pinaceae)、柏科(Cupressaceae)、白蠟樹屬(Fraxinus)、楊屬(Populus)是主要的氣傳致敏花粉(Erkara， 2008)。Mardones 等(2013)研究了塔卡爾2007年5月—2008年4月期間大氣花粉粒數(shù)，發(fā)現(xiàn)空氣中花粉數(shù)量最多的樹種是二球懸鈴木(Platanusacerifolia)，其花粉濃度達(dá)到每周平均每日高達(dá)203?！-3； 其次是埃及榕(Acerpseudoplatanus)(116?！-3)，楊屬(103粒·m-3)和木犀欖(Oleaeuropaea)(19?！-3)相對較少。在我國，由于南北地理、海拔、氣溫等差異大，花粉致敏種類不盡相同。我國南方花粉致敏樹種主要有懸鈴木屬(Platanus)、松屬(Pinus)、構(gòu)屬(Broussonetia)等，而北方主要以懸鈴木屬、楊屬、柳屬(Salix)、樺木屬(Betula)為代表(辛嘉楠等， 2007； 楊瓊梁等， 2015)?；ǚ勰芤鹑诉^敏是因?yàn)榛ǚ壑泻心茇菁C(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)的物質(zhì)，其主要成分是蛋白質(zhì)。迄今為止，關(guān)于木本植物花粉過敏原的研究報(bào)道主要有懸鈴木屬(Pla a 1和Pla a 2)(Asturiasetal.， 2002； Ibarrolaetal.， 2004)、樺木屬(Bet v 1,Bet v 2和Bet v 4等)(Ebneretal.， 1995； Twardoszetal.， 1997)、榆屬(Ulmus)(Car b 1)(Hiraharaetal.， 2001)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)(Cry j 1,Cry j 2和Jun a 1)(Larsenetal.， 1992； Midoroetal.， 1999)等。

我國是世界上楊樹人工林面積最大的國家，面積已超666.7萬hm2(賈黎明等， 2013)。楊樹不僅是速生豐產(chǎn)林、防護(hù)林的主要造林樹種，也是我國城市綠化常用的樹種，楊樹的花期3—4月，雄株產(chǎn)生大量的花粉，具有過敏的潛能。為了解楊樹花粉致敏原，本實(shí)驗(yàn)室建立了楊樹花粉蛋白提取和分離技術(shù)體系，并對美洲黑楊36號楊(P.deltoides‘2KEN8’)花粉進(jìn)行了蛋白分離和致敏蛋白預(yù)測(Zhangetal.， 2015)，為研究其他楊樹種質(zhì)花粉致敏性奠定了基礎(chǔ)。楊樹種類繁多，不同種質(zhì)間的花粉致敏性可能存在差異。為了探索不同楊樹種質(zhì)間花粉致敏蛋白的表達(dá)特性差異，本文選用目前生產(chǎn)上常見的6份楊樹種質(zhì)為研究材料，開展了楊樹不同種質(zhì)花粉萌發(fā)率、花粉管長度等基本特性研究； 并利用差異蛋白質(zhì)組技術(shù)，以36號楊成熟花粉預(yù)測的28個(gè)致敏蛋白為基礎(chǔ)，對其他5份楊樹種質(zhì)間花粉致敏蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了比較，為探索楊樹不同種質(zhì)的花粉致敏性差異、選育低致敏楊樹品種以及控制植物過敏性疾病等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花粉收集與保存

6份楊樹種質(zhì)[36號楊(Populusdeltoides‘2KEN8’)、南楊(P.deltoides‘Nanyang’)、110楊(P.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’)、森海2號楊(P.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’)、小葉楊(P.simonii)和鉆天楊(P.nigravar.italica)]花枝于2015年3月采自北京、河北和河南(表1)。將花枝適當(dāng)修剪，在室內(nèi)進(jìn)行隔離水培，室溫(20±2) ℃。待雄花成熟散粉時(shí)，用培養(yǎng)皿收集花粉，室溫晾干后，裝于50 mL離心管中，在-20 ℃冰箱中保存。

1.2 花粉離體培養(yǎng)

采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行楊樹花粉萌發(fā)試驗(yàn)(胡超， 2011)，稍有改動。將花粉從-20 ℃冰箱中取出，每份楊樹種質(zhì)稱取0.01 mg花粉，在4 ℃條件下充分吸水4 h。將花粉均勻撒入液體培養(yǎng)基(15%蔗糖 + 100 mg·L-1硼酸 + 300 mg·L-1CaCl2+ 200 mg·L-1MgSO4+ 100 mg·L-1KNO3，pH6.0)上，21 ℃暗培養(yǎng)2，4，8，12，24 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)數(shù)并測量花粉管長度。每個(gè)處理隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野花粉粒不少于30個(gè)，以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)。萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù) × 100%。每個(gè)樣品在不同培養(yǎng)時(shí)間隨機(jī)選取50個(gè)已萌發(fā)的花粉，采用顯微測微尺測量花粉管長度。每份種質(zhì)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 成熟花粉可溶性總蛋白的提取

采用三氯乙酸丙酮(TCA-丙酮)沉淀法提取5份楊樹種質(zhì)成熟花粉可溶性總蛋白質(zhì)(Zhangetal.， 2015)。具體操作： 將花粉從-20 ℃冰箱中取出，稱取1 mg花粉，置于4 ℃條件下充分吸水4 h。加液氮充分研磨至粉末，置于100 mL預(yù)冷的TCA-丙酮溶液(10%TCA，0.07%β-巰基乙醇)中，震蕩混勻后在-20 ℃條件下靜置過夜，再14 000 r·min-1離心30 min，棄上清； 用冷丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)沖洗沉淀1 h后，14 000 r·min-1離心30 min，重復(fù)上述步驟3～4次，直至沉淀物為白色； 真空凍干成干粉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 成熟花粉可溶性總蛋白的雙向電泳

按照1 mg·mL-1的比例用蛋白質(zhì)裂解緩沖液[7 mol·L-1尿素，65 mmol·L-1DTT，4%(W/V)CHAPS，0.01%PMSF，0.2%載體兩性電解質(zhì)]溶解凍存的蛋白樣品，并用Bradford法測定蛋白濃度。取600 μg樣品與水化液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4%CHAPS，65 mmol·L-1DTT，0.002 kg·L-1Bio-Lyte)充分混合后作為上樣樣品，總體積為350 μL。首先，使用非線性IPG固相膠條進(jìn)行第1向等電聚膠電泳。電泳結(jié)束后，立即將IPG膠條依次于10 mL平衡液Ⅰ[6 mol·L-1尿素，0.02 kg·L-1SDS，0.375 mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，30%甘油，0.02 kg·L-1DTT]和平衡液Ⅱ[6 mol·L-1尿素，0.021 kg·L-1SDS，0.375 mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)， 20%甘油，0.04 kg·L-1碘乙酰胺]中各平衡15 min。然后進(jìn)行第2向電泳，待溴酚藍(lán)線至凝膠底部邊緣時(shí)停止電泳，將SDS-PAGE膠在固定液中(10%乙酸，40%甲醇，50%ddH2O)震蕩過夜，再轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍(lán)G-250染色液(0.1%G-250，25%異丙醇，10%冰醋酸)中震蕩染色13 h。 最后用ddH2O脫色至背景近無色。每個(gè)品種的雙向電泳試驗(yàn)平行重復(fù)3次，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

表1 試驗(yàn)材料基本情況Tab. 1 The background of experimental materials

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

楊樹花粉總RNA提取方法參照植物總RNA提取試劑盒(RNeasy Plant Kit)使用說明書，將提取的RNA純化后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa，China)，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer3 Input 0.4.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，其引物序列見表2。參照SYBR? Premix Ex TaqTMKit(TaKaRa，China)配制PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)在Roche480(Roche，USA)上進(jìn)行，程序?yàn)椋?95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)； 60 ℃ 1 min； 50 ℃ 30 s。以PtActin作為內(nèi)參對照，以36號楊的致敏相關(guān)基因作為對照組，qRT-PCR數(shù)據(jù)分析參照采用2-ΔΔCt方法(Pfaffl， 2001)。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和4次技術(shù)重復(fù)。

表2 用于qRT-PCR分析致敏蛋白基因的引物Tab. 2 Primers used in RT-PCR analysis of the allergenic proteins

1.6 分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0和Originlab 9.0軟件進(jìn)行方差分析、顯著性分析和圖表分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)率及花粉管長度差異分析

通過光學(xué)顯微鏡分別觀察6份楊樹種質(zhì)成熟花粉在暗培養(yǎng)2，4，8，12和24 h后的萌發(fā)動態(tài)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)花粉的數(shù)量，并測量花粉管長度。當(dāng)培養(yǎng)到2 h時(shí)，花粉粒已經(jīng)吸水膨大，部分花粉粒的花粉管已經(jīng)伸出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，花粉萌發(fā)率和花粉管長度逐漸提高(圖1A)。萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果顯示，除森海2號楊花粉一直沒有萌發(fā)外，其他5份楊樹種質(zhì)的花粉萌發(fā)率均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸提高。36號楊和南楊花粉萌發(fā)較快，在培養(yǎng)2 h時(shí)，萌發(fā)率分別為29.12%(±0.16%)和21.44%(±0.25%)； 在培養(yǎng)4 h時(shí)，鉆天楊花粉萌發(fā)率迅速增加，達(dá)到36.67%(±0.02%)； 在培養(yǎng)8 h時(shí)，110楊花粉仍未萌發(fā)； 在培養(yǎng)12 h時(shí)，小葉楊和110楊花粉萌發(fā)率迅速增加到41.74%(±1.51%)和38.83%(±0.16%)； 在培養(yǎng)24 h時(shí)，36號楊花粉萌發(fā)率最大，高達(dá)74.42%(±2.36%)，其他依次是南楊67.23%(±2.10%)、鉆天楊62.54%(±0.01%)、小葉楊56%(±0.04%)和110楊42.23%(±1.95%)。差異分析結(jié)果顯示，不同楊樹種質(zhì)的花粉萌發(fā)率差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)(圖1B)。由圖1C可看出，楊樹花粉管平均長度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。培養(yǎng)24 h時(shí)，鉆天楊花粉管平均長度為456.00 μm(±2.05 μm)，其他依次為南楊410.10 μm(±11.31 μm)，110楊390.06 μm(±12.59 μm)，36號楊310.16 μm(±11.13 μm)和小葉楊276.44 μm(±11.08 μm)，而且不同楊樹種質(zhì)的花粉管萌發(fā)長度差異也達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。以上結(jié)果表明，36號楊、南楊和鉆天楊花粉活力較高，其次為110楊和小葉楊，森海2號楊活力最差，且不同楊樹種質(zhì)的成熟花粉活力存在明顯差異。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下6份楊樹種質(zhì)花粉萌發(fā)動態(tài)、萌發(fā)率和花粉管長度比較(標(biāo)尺：200 μm)Fig.1 Change of the pollen germination, tube length with time for culturing in six poplar germplasms(Bar：200 μm)A. 花粉萌發(fā)0，2，4，8，12，24 h的萌發(fā)狀態(tài)； B. 6份楊樹種質(zhì)的花粉萌發(fā)率； C. 6份楊樹種質(zhì)的花粉管長度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化。A. Pollen germinating state at 0, 2, 4, 8, 12 and 24 h respectively; B. Pollen germination rate of six poplar germplasms; C. Change of pollen tube length with culturing time of poplar germplasms.

2.2 楊樹成熟花粉蛋白的雙向電泳圖譜分析

南楊、110楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊成熟花粉蛋白的2-DE電泳圖譜(圖2)十分相似，表明該5份楊樹種質(zhì)之間可以進(jìn)行差異蛋白表達(dá)量的分析。利用Imagemaster 2D Platinum 6.0軟件對5份楊樹種質(zhì)花粉的2-DE圖譜進(jìn)行比較分析，在南楊、110楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊的2-DE圖譜上分別檢測到449，442，428，419和422個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，5份楊樹種質(zhì)間共有408個(gè)蛋白點(diǎn)相匹配，這些蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量范圍為5～63 kDa，等電點(diǎn)為4～7。但是，5份楊樹種質(zhì)成熟花粉卻未發(fā)現(xiàn)特異蛋白。

圖2 5份楊樹種質(zhì)成熟花粉2-DE圖譜Fig.2 2-DE profile of mature pollen of five poplar germplasms

2.3 致敏蛋白在不同楊樹種質(zhì)的表達(dá)差異分析

以36號楊已鑒定的28個(gè)潛在致敏蛋白(Zhangetal.， 2015)為參照，對其他5份楊樹種質(zhì)成熟花粉的致敏蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行分析。從表3中可看出，南楊有22個(gè)致敏蛋白，森海2號楊有21個(gè)致敏蛋白，110楊有20個(gè)致敏蛋白，小葉楊有19個(gè)致敏蛋白，鉆天楊的致敏蛋白數(shù)量最少，為18個(gè)。與36號楊中的28個(gè)潛在致敏蛋白相比，有6個(gè)致敏蛋白點(diǎn)(spot 22，66，84，142，144，184)在該5份種質(zhì)成熟花粉中均不存在，其他22個(gè)致敏蛋白點(diǎn)在電泳圖譜中的放大圖如圖3所示。隨后，對該22個(gè)致敏蛋白進(jìn)行差異表達(dá)量分析，其中有12個(gè)致敏蛋白(spot 3，5，78，95，117，135，156，164，181， 197， 200， 203)在5份楊樹種質(zhì)中表達(dá)量較低，其相對表達(dá)量范圍為-3.99～-0.02，其中森海2號楊和小葉楊表達(dá)量最低，其平均相對表達(dá)量分別為-1.83和-1.98。差異分析顯示，森海2號楊和小葉楊分別有10個(gè)和8個(gè)致敏蛋白顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于36號楊。南楊和鉆天楊表達(dá)量稍低，分別為-0.83和-0.54。有3個(gè)致敏蛋白(spot 133， 208，216)在5份種質(zhì)間表達(dá)量均較高。其中南楊最高，其平均相對表達(dá)量為2.88，均極顯著大于36號楊(P<0.01)； 其次為鉆天楊(2.60)、森海2號楊(1.19)、110楊(0.83)和小葉楊(0.81)。組間差異方差分析發(fā)現(xiàn)，南楊和鉆天楊的17個(gè)致敏蛋白表達(dá)量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于小葉楊和森海2號楊，例如肌球蛋白抑制蛋白4(spot 216)在南楊的表達(dá)量高達(dá)小葉楊的8倍之多。

表3 致敏蛋白在不同楊樹種質(zhì)間的表達(dá)量差異分析①Tab. 3 The different expression of allergic protein among different poplar germplasms

① “—”代表該種質(zhì)花粉沒有這個(gè)致敏蛋白點(diǎn)； “*”，“**”分別代表對照組與試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。“—”represents the germplasm without this allergenic protein; “*”, “**” represent significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01)difference between control and treatment, respectively.

圖3 5份楊樹種質(zhì)的致敏蛋白點(diǎn)的放大Fig.2 Enlargement view of allergenic proteins in five poplar germplasms

2.4 致敏蛋白編碼基因在楊樹花粉中的轉(zhuǎn)錄水平

為進(jìn)一步了解致敏蛋白編碼基因在6份楊樹種質(zhì)間的轉(zhuǎn)錄水平，隨機(jī)選取9個(gè)致敏蛋白基因，通過qRT-PCR對這9個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示，spot 12，51， 200和216蛋白編碼基因在南楊和鉆天楊中的表達(dá)量顯著(P<0.05)或極顯著高于其他種質(zhì)； spot 44和spot 197蛋白編碼基因在森海2號楊、小葉楊和鉆天楊中的表達(dá)量極顯著高于其他種質(zhì)； spot 161蛋白編碼基因在南楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊花粉中的表達(dá)量均是對照組36號楊的4 700倍以上，在鉆天楊花粉中的表達(dá)量竟高達(dá)8 453.06(±267.47)倍； spot 5蛋白編碼基因僅在小葉楊中表達(dá)相對較高，達(dá)到顯著水平； spot 80蛋白編碼基因在5份種質(zhì)花粉中的表達(dá)差異不顯著。綜合以上分析表明，9個(gè)致敏蛋白編碼基因中，大多在南楊和鉆天楊中表達(dá)量較高，而在森海2號楊和小葉楊中表達(dá)量較低，這與前面致敏蛋白在5份種質(zhì)間的表達(dá)模式相一致。因此，差異定量結(jié)果分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果。

圖4 qRT-PCR分析致敏相關(guān)基因在楊樹成熟花粉中的表達(dá)情況Fig.4 Expression of related allergenic genes in poplar mature pollen by qRT-PCR “*”和“**”分別代表對照組與試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。 “*” and “**” represent significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01) difference between control and treatment, respectively.

3 討論

過敏原作為花粉的激發(fā)物質(zhì)，分析其在不同楊樹種質(zhì)的差異對于低致敏品種選育具有重要意義。從本研究中的6份楊樹種質(zhì)成熟花粉致敏蛋白數(shù)量、表達(dá)量及致敏蛋白編碼基因表達(dá)量來看，南楊和鉆天楊的致敏蛋白表達(dá)量顯著或極顯著大于其他楊樹種質(zhì)。其致敏蛋白主要涉及蛋白質(zhì)的合成與加工(spot 3，5，95，156， 197)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(spot 200， 201和203)、糖酵解(spot 44，51和133)以及防御或脅迫反應(yīng)(spot 78，135和208)，這些蛋白為植物花粉的發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量保障，促進(jìn)花粉的萌發(fā)，與花粉萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果相符。Ole e 1是木犀欖花粉主要過敏原，90%木犀欖花粉過敏患者的過敏原都是Ole e 1(Quiralteetal.， 2002)，其同源成員被鑒定為許多植物花粉的過敏原，如木樨科(Oleaceae)[如歐梣(Fraxinusexcelsior)、紫丁香(Syringaoblata)和歐洲女貞(Ligustrumvulgare)等]、平車前(Plantagodepressa)、藜(Chenopodiumalbum)等，但Ole e 1家族蛋白具體的功能和作用機(jī)制目前尚不清楚(Lombarderoetal.， 2002)。在本研究中，Ole e 1家族蛋白(spot 161)在南楊、森海2號楊、小葉楊和鉆天楊花粉中的表達(dá)量均是對照組36號楊的4 700倍以上，特別是在鉆天楊花粉的表達(dá)量竟高達(dá)8 453.06(±267.47)倍，故推測Ole e 1可能是楊樹花粉的主要過敏原。此外，有6個(gè)致敏蛋白在5份種質(zhì)花粉中均沒有檢測到表達(dá)情況，這可能是由于其表達(dá)量相對較低，雙向電泳技術(shù)很難檢測出來。

三倍體植物具有產(chǎn)量高和抗性強(qiáng)的雙重優(yōu)勢，但是其花粉育性低(楊詩勤， 2014)。森海2號楊是通過人工雜交選育出的抗性強(qiáng)的優(yōu)良三倍體新品種(賈會霞等， 2015)。在本研究中，森海2號楊的花粉沒有萌發(fā)，可能由于多倍體小孢子母細(xì)胞發(fā)育異常造成花粉活力差和育性低(曹媛等， 2012)，而且其致敏蛋白表達(dá)水平也顯著低于其他種質(zhì)。Kondo等(1997)發(fā)現(xiàn)三倍體日本柳杉(Cryptomeriajaponica)花粉過敏原Cry j 1和Cry j 2含量低于二倍體，認(rèn)為三倍體植物可能具有低致敏性，可以考慮作為低致敏楊樹品種選育的一個(gè)方面。目前，對于三倍體花粉的低育性、低致敏性的機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。而且，本研究只是比較了楊樹不同種質(zhì)的成熟花粉致敏蛋白差異，未對花粉萌發(fā)的不同階段進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析。相關(guān)研究表明，花粉萌發(fā)伴隨著表達(dá)基因數(shù)量的降低及特異性轉(zhuǎn)錄本的增加，同時(shí)也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)組的變化(趙麗娟， 2011)。因此，花粉萌發(fā)可能會丟失或產(chǎn)生過敏蛋白，值得進(jìn)一步研究。

本研究表明，不同楊樹種質(zhì)間致敏蛋白表達(dá)量和致敏性存在差異，但問題是，致敏蛋白表達(dá)量的高低和致敏蛋白基因的表達(dá)量的多少與致敏性強(qiáng)弱有直接關(guān)聯(lián)嗎？Son等(1999)認(rèn)為蘋果(Malus×domestica)不同品種間的致敏性差異主要與過敏原的表達(dá)量差異有關(guān)。Bolhaar等(2005)通過酶聯(lián)免疫測定金冠蘋果的Mald 1(蘋果主要過敏原)含量遠(yuǎn)低于‘Jonathan’品種，但前者的Mald 1同患者血清中的抗體(sIgE)結(jié)合能力要強(qiáng)于后者。Zuidmeer等(2006)通過體外免疫測定方法，進(jìn)一步研究了造成這種結(jié)果沖突的原因，認(rèn)為可能是過敏原結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，難以控制。本研究初步探索了5份楊樹種質(zhì)成熟花粉致敏蛋白的表達(dá)特性，在今后的研究中，可以結(jié)合 IgE 檢測、組胺釋放試驗(yàn)(HAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等技術(shù)測定過敏原對患者血清中抗體結(jié)合能力的強(qiáng)弱來驗(yàn)證致敏蛋白的表達(dá)量與致敏性的相關(guān)性以及確定低致敏性楊樹種質(zhì)(Sichereretal.， 2010)。同時(shí)，還可以借助現(xiàn)代分子生物技術(shù)如RNA干擾進(jìn)行基因沉默，以達(dá)到消除致敏蛋白的目的(Galloetal.， 2009)。

4 結(jié)論

本研究通過楊樹成熟花粉萌發(fā)試驗(yàn)、差異蛋白質(zhì)組、qRT-PCR技術(shù)對不同楊樹種質(zhì)花粉中致敏蛋白表達(dá)量的差異進(jìn)行了分析，結(jié)果表明楊樹不同種質(zhì)的花粉活力、致敏蛋白表達(dá)水平存在顯著差異。其中36號楊、南楊和鉆天楊花粉活力較高； 南楊和森海2號楊的致敏蛋白數(shù)量最多，小葉楊和鉆天楊的致敏蛋白數(shù)量最少，且22個(gè)致敏蛋白在6份楊樹種質(zhì)的表達(dá)存在很大差異，南楊和鉆天楊致敏蛋白表達(dá)量極顯著高于其他種質(zhì)。該結(jié)果對今后篩選低致敏楊樹品種及控制植物過敏性疾病等研究具有重要參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Differences in Pollen Germination and Allergenic Proteins among DifferentPopulusGermplasms

Zhang Xiaoling1Wang Liuqiang1Sun Pei1Wu Lishuan2Fan Wei1Zhang Jin1Lu Mengzhu1Hu Jianjun1

(1.StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingKeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationoftheStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry,CAFBeijing100091; 2.KeyLaboratoryofPhotobiology,InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciencesBeijing100093)

【Objective】 The characteristics of pollen germination and the differences of allergenic proteins among six poplar germplasms (Populusdeltoides‘2KEN8’,P.deltoides‘Nanyang’,P.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’,P.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’,P.simoniiandP.nigravar.italica) were studied to provide a theoretical basis and scientific evidence for breeding hypoallergenic poplar varieties and for the control of plant allergy. 【Method】 Pollen was collected from flower branches of six poplar germplasms collected from Beijing, Hebei and Henan in March 2015 for a period of hydroponic culture, pollen germination was studied by liquid culture method, and pollen allergenic proteins of different poplar germplasms was used by two-dimensional electrophoresis and real-time quantitative PCR. 【Result】 1) The pollen viability ofP.deltoides‘2KEN8’,P.deltoides‘Nanyang’ andP.nigravar.italicawas higher, followed byP.simoniiandP.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’, however, the viability ofP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ was the worst; the largest pollen germination rate was inP.deltoides‘2KEN8’, up to 74.42% (±2.36%), while the pollen germination of triploidP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ was 0; the average length of pollen tube ofP.nigravar.italicawas 456 μm (±2.05 μm), the shortest was inP.simonii, 276.44 μm (±11.08 μm), and the difference of pollen germination rate and pollen tube length among different entities were highly significant (P<0.01), suggesting that the pollen viability was significantly different among different germplasms. 2) The 2-DE maps ofP.deltoides‘Nanyang’,P.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’,P.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’,P.simoniiandP.nigravar.italicamature pollen were analyzed by Imagemaster 2D platinum 6.0, a total of 408 protein spots were matched. Based on the 28 potentially allergenic proteins ofP.deltoides‘2KEN8’ identified in our previous study, 6 allergenic proteins were missing expression in the other five entities; bothP.nigravar.italicaandP.deltoides‘Nanyang’ had 21 allergenic proteins,P.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’ had 19; whileP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ andP.deltoides‘2KEN8’ had the least number of allergenic proteins, only 18. Morover, the analysis of difference expression indicated that 12 of the 22 remaining allergenic proteins were less expressed in the five entities than inP.deltoides‘2KEN8’, the range of relative expression level was -3.99--0.02. The expression level ofP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ andP.simoniiwas the least, especially they had 10 and 8 allergenic proteins which were significantly or highly significant lower than that ofP.deltoides‘2KEN8’, respectively. The expression of 3 allergenic proteins in the 5 entities was higher than inP.deltoides‘2KEN8’. The strongest expression was inP.deltoides‘Nanyang’, significantly greater than inP.deltoides‘2KEN8’, followed byP.nigravar.italica,P.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’,P.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’ andP.simonii. Variance analysis among groups suggested that the expression of 17 allergenic proteins ofP.nigravar.italicaandP.deltoides‘Nanyang’ were significantly (P<0.05) or highly significantly (P<0.01) greater than that ofP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ andP.simonii. 3) qRT-PCR results showed that there were 5 of 9 allergenic proteins encoding genes highly expressed inP.nigravar.italicaandP.deltoides‘Nanyang’, including spot 12, 51, 200, 216 and 161, followed byP.simonii, while both ofP.deltoides×P.maximowiczii‘Eridano’ andP.deltoides×P.cathayana‘Senhai 2’ had only 2 highly expressed allergenic protein coding genes.【Conclusion】 The pollen viability, the number and expression levels of allergenic proteins were significantly different among the 6 germplasm entities, providing an important basis for future breeding of new poplar hypoallergenic varieties. However, further study is needed to understand the correlation between expression levels and allergenicity of the allergenic proteins of mature pollen.

Populus; mature pollen; allergenic protein; two-dimensional electrophoresis; real-time quantitative PCR

10.11707/j.1001-7488.20170207

2016-04-06；

2016-04-19。

“十二五”林業(yè)行業(yè)公益類重大專項(xiàng)(201304103)。

S718.43

A

1001-7488(2017)02-0054-11

*胡建軍為通訊作者。