盧庭婷 梁惠萍黃 艷 韋小玲

(廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧市 530021)

HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與廣西青年女性宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究▲

盧庭婷 梁惠萍*黃 艷 韋小玲

(廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧市 530021)

目的探討HLA-DRB1等位基因多態(tài)性對(duì)廣西青年女性宮頸癌發(fā)生的影響，為尋找廣西女性宮頸癌的遺傳易感基因或拮抗基因提供線索。方法選取廣西地區(qū)25～35歲確診為宮頸癌的患者(宮頸癌組)、無(wú)癌健康年輕女性(對(duì)照組)各57例作為研究對(duì)象，采集研究對(duì)象外周血并提取基因組DNA，應(yīng)用 PCR-SSP方法對(duì)HLA-DRB1等位基因進(jìn)行基因型檢測(cè)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果宮頸癌組 HLA-DRB1*04/10等位基因出現(xiàn)頻率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);宮頸癌組 HLA-DRB1*09等位基因出現(xiàn)頻率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而兩組間HLA-DRB1*01/07/08/11/12/13/14/15/16/17/18等位基因出現(xiàn)頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論HLA-DRB1*04/10等位基因可能是廣西青年女性宮頸癌發(fā)生的易感基因;HLA-DRB1*09等位基因可能是廣西青年女性宮頸癌的保護(hù)基因。而HLA-DRB1*01/07/ 08/11/12/13/14/15/16/17/18等位基因可能與廣西青年女性宮頸癌遺傳易感性無(wú)關(guān)。

HLA-DRB1;宮頸癌;遺傳易感性

宮頸癌是威脅女性生命的第二大惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，每年全球新發(fā)病例約50萬(wàn)例［1］。我國(guó)宮頸癌的患病率和病死率約占全世界的1/3［2］。宮頸癌系多因素關(guān)聯(lián)疾病，其中高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素［3］，但并非所有的HPV感染者最終都發(fā)展為宮頸癌。研究表明，在HPV致癌過(guò)程中協(xié)同宿主的遺傳易感性是宿主感染HPV后是否發(fā)生腫瘤的關(guān)鍵因素［4］。近年來(lái)，HLA基因多態(tài)性對(duì)宮頸癌等腫瘤的遺傳易感性備受關(guān)注［5］，尤其是HLAⅡ類基因中的DRB1、DQB1與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)［6］。為了明確HLA-DRB1對(duì)廣西女性宮頸癌易感性的影響及相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物(PCR-SSP)的方法，檢測(cè)廣西地區(qū)57例宮頸癌年輕患者和57例宮頸細(xì)胞學(xué)正常的年輕婦女的HLA-DRB1等位基因，以初步探討HLA-DRB1等位基因與廣西青年女性宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)，為尋找廣西女性宮頸癌的遺傳易感基因或拮抗基因提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月至2016年5月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的宮頸癌患者57例為宮頸癌組，年齡25～35歲;另選取同期在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受宮頸癌篩查，年齡、民族與宮頸癌組相匹配的57名健康女性為對(duì)照組。所有入選對(duì)象均為廣西戶籍，對(duì)照組均無(wú)腫瘤病史，研究對(duì)象相互間均無(wú)血緣關(guān)系。本研究已通過(guò)廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院倫理委員會(huì)的審批，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，接受流行病學(xué)調(diào)查并提供血液標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理 采集兩組研究對(duì)象的空腹外周靜脈血5 mL(EDTA抗凝)，混勻后進(jìn)行600 μL/管分裝，－80℃冰箱保存，待提取外周血白細(xì)胞DNA。

1.2.2 基因組DNA的提取 取冷凍的血樣600 μL，提取DNA的步驟嚴(yán)格按照艾德萊生物科技有限公司的人基因組DNA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后使用超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)DNA的純度與濃度，DNA的純度(A260/A280值)在1.6～2.0，濃度在20～100 ng/μL的樣品可以用于PCR檢測(cè)。

1.2.3 基因型檢測(cè) 選用天津秀鵬公司的HLA-DR基因分型低分辨測(cè)定試劑盒(PCR-SSP法)進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 ①PCR反應(yīng)體系:先配制 dNTP-BufferⅠ 工作液:在 440 μL濃縮dNTP-BufferⅠ中加入560 μL純化水，震蕩混勻數(shù)秒，800 rpm離心數(shù)秒;每人份用量:取210 μL dNTP-BufferⅠ工作液，加入21 μL DNA，混勻，點(diǎn)動(dòng)離心數(shù)秒;在引物板中，每人份(1～21孔)每孔各加入10 μL上述混合液，最后每孔再分別加入15～20 μL石蠟油蠟封，用密封膜封好PCR反應(yīng)板(引物板)。②PCR擴(kuò)增條件:將PCR反應(yīng)板放入PCR儀樣本槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。按表1設(shè)定的參數(shù)，啟動(dòng)PCR反應(yīng)程序直至循環(huán)結(jié)束:③PCR產(chǎn)物鑒定:從PCR擴(kuò)增儀中取出PCR反應(yīng)板，點(diǎn)動(dòng)離心，輕輕撕掉密封膜。按照引物孔位圖的順序，將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物(6 μL)加樣到2.5%(m/v)的瓊脂糖凝膠孔中。150V電泳10～15 min，內(nèi)參帶與陽(yáng)性帶清晰分開(kāi)時(shí)即可停止電泳。

表1 PCR擴(kuò)增條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，HLA-DRB1各基因位點(diǎn)分布的組間比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察及判讀結(jié)果 在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍攝成像，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)中提供的結(jié)果分型表判讀基因分型情況。詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 結(jié)果分析 等位基因HLA-DRB1*04、HLA-DRB1 *10在宮頸癌組中出現(xiàn)的頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);等位基因HLA-DRB1*09在宮頸癌組中出現(xiàn)的頻率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);等位基因HLA-DRB1*01/07/08/11/12/ 13/14/15/16/17/18在兩組間的頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表2。

圖1 HLA-DRB1等位基因的PCR擴(kuò)增電泳圖(宮頸癌組)

參照結(jié)果分型表，宮頸癌組中標(biāo)本T409在第6、16、18、20、21泳道出現(xiàn)陽(yáng)性帶，為HLA-DRB1*04和HLA-DRB1 *14的雜合體。

圖2 HLA-DRB1等位基因的PCR擴(kuò)增電泳圖(對(duì)照組)

參照結(jié)果分型表，對(duì)照組中標(biāo)本C145在第2、3、19泳道出現(xiàn)陽(yáng)性帶，為HLA-DRB1*15和HLA-DRB1*16的雜合體。

表2 宮頸癌患者組與無(wú)癌對(duì)照組中HLA-DRB1各等位基因頻率分布比較

3 討論

由于HLA-DR基因的多態(tài)性，對(duì)該等位基因與疾病相關(guān)性的研究已經(jīng)成為HLA系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)［7］。但是，縱觀國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HLA-DR的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同種族間研究結(jié)果的差異較大［8］，這可能是因?yàn)槿巳寒愘|(zhì)性、樣本含量等原因，造成不同研究結(jié)果無(wú)法重復(fù)，甚至相互矛盾。例如，Cuzick等［9］在英國(guó)人中的研究顯示，HLA-DRB1*03等位基因與宮頸癌呈正相關(guān);而Wang等［10］在哥斯達(dá)黎加人中的研究顯示，HLA-DRB1*03等位基因與宮頸癌無(wú)相關(guān)性。Climent等［11］研究發(fā)現(xiàn)，DRB1*11和DRB1*16與宮頸癌呈正相關(guān)，而DRB1*01/04/14/15則顯示呈負(fù)相關(guān)。而國(guó)內(nèi)的李華等［12］報(bào)道，HLA-DRB1*15可能是新疆喀什維吾爾族婦女宮頸癌的易感基因;而HLA-DRB1*04可能是喀什維吾爾族婦女宮頸癌的保護(hù)基因。而楊桂芳等［13］認(rèn)為HLA-DRB1*15與宮頸癌易感性無(wú)關(guān)。張素琴等［14］認(rèn)為HLA-DRB1*15和HLA-DRB1*04都是有宮頸癌家族史的危險(xiǎn)因素，這與李華報(bào)道的HLA-DRB1*04是喀什維吾爾族婦女宮頸癌的保護(hù)基因相矛盾［12］。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組HLA-DRB1*04/10等位基因出現(xiàn)頻率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，提示HLA-DRB1*04/10等位基因可能是廣西青年女性宮頸癌發(fā)生的易感基因。此外，宮頸癌組HLA-DRB1*09等位基因出現(xiàn)頻率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示HLA-DRB1*09等位基因可能是廣西青年女性宮頸癌的保護(hù)基因。而兩組間的HLA-DRB1*01/07/08/11/ 12/13/14/15/16/17/18等位基因出現(xiàn)頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，由此推測(cè)HLA-DRB1*01/07/08/11/12/ 13/14/15/16/17/18等位基因可能與廣西青年女性宮頸癌易感性無(wú)關(guān)。本次研究收集的樣本量較少，但兩組成員的年齡、地域及民族是一致的，這在一定程度上排除了年齡、地域、民族這些混雜因素對(duì)研究結(jié)果的影響。此結(jié)果與李華的結(jié)果相矛盾，但卻與楊桂芳的結(jié)果相一致(認(rèn)為HLA-DRB1*15與宮頸癌易感性無(wú)關(guān))。而HLA-DRB1*04基因可能是廣西青年女性宮頸癌發(fā)生的易感基因這一點(diǎn)也與張素琴的結(jié)果相一致而與李華的結(jié)果相矛盾。分析其原因可能是由于HLA等位基因在不同種族、不同地域人群分布有差異，在一個(gè)種族有陽(yáng)性意義的等位基因在另一個(gè)種族可能就沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即使在同一個(gè)種族，在不同地區(qū)的HLA等位基因的出現(xiàn)頻率也會(huì)有所不同。另外，也可能是由于目前的研究方法、研究對(duì)象以及樣本量的選擇等方面均缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這些原因都可能導(dǎo)致不同地區(qū)、不同人群研究結(jié)果之間存在差異和矛盾。

本研究在一定程度上說(shuō)明了廣西地區(qū)青年女性HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于宮頸癌與HLA-DRB1基因多態(tài)性方面的研究還不多，故有必要在今后的研究中鑒定和篩選出更多有價(jià)值的宮頸癌的易感基因和保護(hù)基因，從而為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供理論依據(jù)。

［1］Poggio JL.Premalignant lesions of the anal canal and squamous cell carcinoma of the anal canal［J］.Clin Colon Rectal Surg，2011，24(3):177－192.

［2］Li S，Hu T，Lv W，et al.Changes in prevalence and clinical characteristics of cervical cancer in the People's Republic of China:a study of 10，012 cases from a nationwide working group［J］.Oncologist，2013，18(10):1101－1107.

［3］Lin CW，Lin CC，Mo LR，et al.Heavy alcohol consumption increases the incidence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus-related cirrhosis［J］.J Hepatol，2013，58(4):730－735.

［4］Castro FA，Haimila K，Sareneva I，et al.Association of HLA-DRB1，interleukin-6 and cyclin D1 polymorphisms with cervical cancer in the Swedish population--a candidate gene approach［J］.Int J Cancer，2009，125(8):1851－1858.

［5］魏林珍，王海琳，錄亞鵬，等.中國(guó)人群HLA-DRB1基因多態(tài)性與宮頸癌易感性的Meta分析［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21(3):264－267.

［6］祖菲婭·艾力，再努爾·阿布都熱衣木，拉萊·蘇祖克，等.喀什維吾爾族宮頸癌患者HPV16型感染及其人類白細(xì)胞抗原-DQB1基因多態(tài)性的關(guān)系［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(3):274－277.

［7］樊曉妹，單保恩，李魁秀.基因多態(tài)性與宮頸癌易感性研究進(jìn)展.［J］.中華腫瘤防治雜志，2014，21(14):1125－1128.

［8］Nieters A，Yuan JM，Sun CL，et al.Effect of cytokine genotypes on the hepatitis B virus-hepatocellular carcinoma association［J］.Cancer，2005，103(4):740－748.

［9］Cuzick J，Terry G，Ho L，et al.Association between highrisk HPV types，HLA DRB1*and DQB1*alleles and cervical cancer in British women［J］.Br J Cancer，2000，82(7):1348－1352.

［10］Wang SS，Wheeler CM，Hildesheim A，et al.Human leukocyte antigen classⅠandⅡalleles and risk of cervical neoplasia:results from a population-based study in Costa Rica［J］.J Infect Dis，2001，184(10):1310－1314.

［11］Climent C，Nazario CM，Umpierre S，et al.Major histocompatibility complex classⅡpolymorphisms and risk of cervical cancer in Puerto Rican women［J］.P R Health Sci J，2007，26(2):97－101.

［12］李 華，百合尼莎·阿不都熱西提，張?zhí)K琴，等.喀什維吾爾族婦女宮頸癌與HLA-DRB1*15和HLA-DRB1* 04的關(guān)系［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，37(5):555－559.

［13］楊桂芳，李艷蕓，賈艷菊，等.子宮頸癌HLA-DRB1基因型的初步研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44(5):383－385.

［14］張素琴，拉來(lái)·蘇祖克，古扎麗努爾·阿不力孜，等.宮頸癌高發(fā)區(qū)新疆墨玉縣有宮頸癌家族史的維吾爾族婦女人類白細(xì)胞抗原等位基因多態(tài)性的分布［J］.中華腫瘤雜志，2012，34(4):272－277.

The relationship between HLA-DRB1 allele polymorphism and susceptibility to cervical cancer of Guangxi young women

LU Tingting，LIANG Huiping*，HUANG Yan，WEI Xiaoling
(Guangxi Medical College，Nanning 530021，China)

ObjectiveStudy on the relationship of Guangxi young women suffering from cervical cancer with HLA-DRB1 allele polymorphism.Provide clues for seeking hereditary susceptibility gene or resistant gene of cervical cancer of Guangxi women.MethodsChoose the cervical cancer diagnosed female patient and health woman 57 cases respectively aged between 25 and 35 of Guangxi as subject investigated.Take their peripheral blood samples to extract genome DNA.Then detect HLA-DRB1 genetype applying PCR-SSP technology.Finally the data were statistically analyzed.ResultsThe allele carrying rate of HLA-DRB1*04/ 10 in the cervical cancer group was higher than the health control group with statistically significant difference (P＜0.05).The allele carrying rate of HLA-DRB1*09 in the cervical cancer group was lower than the health control group with statistically significant difference(P＜0.05).There was no significant difference of the allele carrying rate of HLA-DRB1* 01/07/08/11/12/13/14/15/16/17/18 between two groups (P＞0.05).ConclusionsHLA-DRB1*04/10 alleles are probably the susceptibility genes of cervical cancer of Guangxi young women;HLA-DRB1*09 alleles are probably the protective genes of cervical cancer of Guangxi young women;HLA-DRB1*01/07/08/11/12/13/14/15/16/17/18 alleles seem irrelevant to hereditary susceptibility of cervical cancer of Guangxi young women.

HLA-DRB1;Cervical cancer;Hereditary susceptibility

R 392.11

A

1673-6575(2017)01-0011-04

10.11864/j.issn.1673.2017.01.03

2016-10-30

2016-12-27)

廣西壯族自治區(qū)教育廳 2016年度廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目(編號(hào): KY2016YB740);廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào):YB2014546);廣西壯族自治區(qū)教育廳項(xiàng)目(編號(hào): GXGZJG2015B240)

盧庭婷(1979～)，女，碩士，講師，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

*通信作者