何天明+倪蔚茹+劉青++沈向+陳曉流

摘要：以25株新疆野蘋果（Malus sieversii）及3個當?shù)靥O果品種（嘎啦、夏立萌、紅海棠）的成熟果實為試材，利用超高效液相色譜串聯(lián)四級飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QTOF-MS）測定了果肉類黃酮物質(zhì)的組成和含量，結(jié)果表明：在新疆野蘋果果肉中檢測出9種含量較高的類黃酮物質(zhì)；新疆野蘋果與當?shù)仄贩N果肉中檢測到的類黃酮組分基本一致，但其含量差異顯著；新疆野蘋果果肉中綠原酸、原花青素B2、表兒茶素的含量基本均遠高于當?shù)仄贩N，其中差異最大的是表兒茶素，其含量最高的GL183是嘎啦含量的82.13倍；新疆野蘋果GL026、GL030、GL053-1、GL172、GL179、GL183果肉的綠原酸、原花青素B2、表兒茶素的含量較高，均超過平均水平。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果；果實；類黃酮；超高效液相色譜串聯(lián)四級飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀

中圖分類號：S661.101文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）03-0046-06

AbstractThe compositions and contents of flavonoids in ripe fruits of 25 strains of Xinjiang wild apple （Malus sieversii） and 3 varieties of local cultivated apple （Gala， Xialimeng and Red Crabapple） were measured using ultra-high performance liquid chromatography & quadrupole-time-of-flight mass spectrometer（UPLC-QTOF-MS）. The results showed that there were 9 kinds of flavonoids with higher contents in Xinjiang wild apple. The compositions of flavonoids in Xinjiang wild apple and local cultivated apple were almost the same， but their contents had significant difference. The contents of chlorogenic acid， procyanidin B2 and epicatechin in Xinjiang wild apple fruit were much higher than those in local cultivated apple， especially epicatechin. Its content was the highest in GL183， which was 82.13 times of that in Gala. And the contents of chlorogenic acid， procyanidin B2 and epicatechin in Xinjiang wild apple strain GL026，GL030，GL053-1，GL172，GL179 and GL183 were higher than the average level.

KeywordsXinjiang wild apple； Fruit； Flavonoids； Ultra-high performance liquid chromatography & quadrupole-time-of-flight mass spectrometer

類黃酮是一類多酚化合物，屬植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜中[1]，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏、擴張血管等多種生理功能[2，3]，同時具有較強的清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫等的能力，其清除自由基能力強于維生素C[4]。新疆野蘋果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]是現(xiàn)代栽培蘋果（Malus domestica Borkh.）的祖先種，長期的自然選擇使單株性狀變異較多，遺傳多樣性豐富，挖掘利用的潛力很大[5，6]。

目前對新疆野蘋果類黃酮的研究較多，馮濤等[7]研究新疆野蘋果葉片多酚組分發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果葉片內(nèi)酚類組分含量和總量在單株之間存在差異，表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性；張小燕等[8]對新疆野蘋果成熟果實多酚物質(zhì)組成、含量和遺傳多樣性進行了研究，鑒定出6種類黃酮物質(zhì)，原花青素、表兒茶素和根皮苷及綠原酸均為主要多酚物質(zhì)，含量顯著高于栽培蘋果品種。高效液相色譜法是類黃酮含量檢測的主要方法，利用該方法測定類黃酮的研究已有較多報道[9-12]，但在新疆野蘋果的果肉類黃酮組成和含量方面尚需進一步研究。本試驗利用高效快速、高分離度的超高效液相色譜串聯(lián)四級飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QTOF-MS）對新疆野蘋果果肉類黃酮進行研究，分析比較不同單株蘋果果肉中類黃酮的種類和含量，以期發(fā)現(xiàn)類黃酮組分豐富及含量高的種質(zhì)資源，并為新疆野蘋果種質(zhì)資源、果實類黃酮利用及高含量類黃酮蘋果品種培育的研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2014年8月中下旬，從新疆伊犁州鞏留縣新疆野蘋果林標定的200株新疆野蘋果植株中隨機選取25株，并選取當?shù)匾吧N紅海棠和栽培品種嘎啦、夏立萌各1株，每株采摘成熟果實不低于30個，低溫保存帶回實驗室，進行果肉類黃酮組分及含量的比較。

1.2試劑

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；標準品：綠原酸、表兒茶素、原花青素 B2（純度≥98%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

1.3試驗方法

1.3.1類黃酮的提取削皮機迅速削皮， 果肉縱切， 進行冷凍干燥、粉碎，-70℃保存。精確稱取0.300 g果肉凍干磨碎樣品， 用4 mL 70%甲醇（含1%甲酸）室溫超聲提取5 min，常溫離心（10 000 r/min， 5 min），取上清，再用3 mL 70%甲醇（含1%甲酸）重復提取一次，合并上清。將上清稀釋10倍，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2類黃酮的測定液相色譜條件：采用 Waters ACQUITY UPLC 色譜儀，色譜分析柱為BEH T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫45℃。流動相：100% 乙腈（A）、0.1 %甲酸（B），A+B=100%。梯度洗脫程序： 開始8.0% A+92.0%B；20 min，30.0%A+70.0%B；25 min，100.0%A；26 min，100.0%A；26.1 min 8.0%A+92.0%B；30 min， 8.0%A+92.0%B，流速0.3 mL/min。進樣量：1 μL。采用Waters ACQUITY PDA檢測器。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀為 Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS，ESI 電離源，電噴霧離子化正離子采集模式（ESI+）。掃描質(zhì)量范圍 50～800 m/z。毛細管電壓 3.0 kV，錐孔電壓 30 V。離子源溫度 100℃，脫溶劑氣溫度 400℃。脫溶劑氣流量 500 L/h。

2結(jié)果與分析

2.1類黃酮物質(zhì)的鑒定

對28株不同的待測樣品進行LC-ESI-MS分析，得到每個樣品的總離子流色譜圖，用MassLynxTM操作軟件將LC-ESI-MS數(shù)據(jù)中每一個數(shù)據(jù)點轉(zhuǎn)換成質(zhì)量-保留時間（anexactmass retention time，簡稱EMRT）數(shù)據(jù)對，并對數(shù)據(jù)進行主成分分析，最后總結(jié)出在28株不同來源的果實中，共檢測分離出9種含量較高的類黃酮物質(zhì)，結(jié)果如圖1所示，LC圖譜上的各個峰對應(yīng)的質(zhì)荷比分別為353.0（3.70 min）、577.1（4.48 min）、289.1（5.32 min）、337.1（5.57 min）、865.1（6.08 min）、463.0（9.20 min）、433.0（10.20 min）、567.0（11.23 min）、435.0（12.95 min）。

分析一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜檢測結(jié)果，結(jié)合文獻[4]、[8]，初步推測出果肉類黃酮物質(zhì)為以下化合物（表1）。

如圖1和表1所示，3.70 min時，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z為353.0的[M-H]-質(zhì)譜峰，碎片離子中有m/z為191的特征片段，而且還出現(xiàn)了m/z為707的[2M-H]-質(zhì)譜峰。因此可以推測該物質(zhì)可能為綠原酸類化合物（隱綠原酸、新綠原酸或綠原酸），根據(jù)蘋果果實中類黃酮物質(zhì)種類[4]，推定該物質(zhì)為綠原酸。4.48 min時，質(zhì)譜圖中顯示存在m/z為577.1的[M-H]-質(zhì)譜峰，由文獻[13]可知該物質(zhì)為黃烷醇二聚體，且二級質(zhì)譜中有m/z為289的碎片離子，初步推測該物質(zhì)為原花青素類二聚體化合物，前人研究[14-17]顯示，蘋果中所含的原花青素二聚體為原花青素B2，因此推測該物質(zhì)為原花青素B2。5.32 min時，質(zhì)譜圖中顯示含有m/z為289.1的分子離子 [M-H]-，加碰撞電壓后出現(xiàn)的是表兒茶素和兒茶素的特征片段，根據(jù)蘋果中所含一般為表兒茶素，推定該物質(zhì)是表兒茶素。5.57 min時，該物質(zhì)質(zhì)譜顯示m/z為337.1的分子離子[M-H]-，根據(jù)文獻[18]可知該物質(zhì)可能為對香豆?？崴帷?.08 min時，質(zhì)譜圖中顯示存在m/z為865.1的[M-H]-質(zhì)譜峰，由文獻[19]可知該物質(zhì)為黃烷醇三聚體，根據(jù)已有研究[20]初步判斷該物質(zhì)可能為原花青素C1。9.20 min時，質(zhì)譜圖中顯示m/z為463.0的 [M-H]- ，該物質(zhì)可能是槲皮素葡萄糖苷或槲皮素半乳糖苷的分子離子，同時，m/z為301的碎片離子為該物質(zhì)去掉一個六碳糖基的離子峰[M-H-162]-。因此推斷該物質(zhì)可能是槲皮素葡萄糖苷或槲皮素半乳糖苷。10.20 min時，出現(xiàn)m/z為433.0的質(zhì)譜峰，可能是槲皮素木糖苷或槲皮素阿拉伯糖苷的分子離子峰 [M-H]-，m/z為301的碎片離子是該物質(zhì)去掉一個五碳糖基的離子峰[M-H-162]-。因此，該物質(zhì)可能是槲皮素木糖苷或槲皮素阿拉伯糖苷。11.23 min時，m/z為567.0的質(zhì)譜峰可能是該成分的準分子離子[M-H]-，而m/z為273的碎片離子則是該物質(zhì)去掉一個六碳糖基的離子，所以推測該物質(zhì)可能為根皮素木糖葡萄糖苷。12.95 min時，m/z為435.0的質(zhì)譜峰，可能是該成分的準分子離子[M-H]-，而m/z為273的碎片離子很可能是該成分去掉一個六碳糖基的離子[M-H-162]-，觀察加碰撞電壓后的質(zhì)譜圖，分子離子峰變小，碎片離子峰變大，綜上推測該物質(zhì)為根皮素葡萄糖苷或根皮素半乳糖苷。

2.2不同樣品果肉中可能存在的類黃酮種類的比較

如表2所示，參試的28個樣品果肉中共檢測到9種類黃酮物質(zhì)，各樣品中類黃酮的種類和含量均不同。綠原酸在所有參試樣品中均能檢測到。原花青素B2在25個新疆野蘋果樣品中均大量存在，而在當?shù)匾吧N紅海棠中未檢測到，在栽培品種嘎啦、當?shù)卦耘喾N夏立萌果肉中是微量存在的。表兒茶素在25個新疆野蘋果果肉樣品中均可檢測到，其中GL009、GL013、GL017、GL112為微量存在；紅海棠果肉中未檢測到；嘎啦、夏立萌果肉中均檢測到微量存在。對香豆?？崴嵩诓糠中陆疤O果及夏立萌果肉樣品中檢測到存在，在紅海棠和嘎啦果肉中均未檢測到。原花青素C1在25個新疆野蘋果果肉樣品中均可檢測到，紅海棠和夏立萌果肉中未檢測到，而嘎啦果肉中檢測到微量存在。槲皮素葡萄糖苷/槲皮素半乳糖苷除在新疆野蘋果GL017、GL170和夏立萌果肉中檢測到微量存在外，其他樣品中均未檢測到。槲皮素木糖苷/槲皮素阿拉伯糖苷在新疆野蘋果及其它3個當?shù)仄贩N果肉中均未檢測到。根皮素木糖葡萄糖苷在新疆野蘋果果肉中均存在，其中GL013、GL039、GL129、GL169、GL172均為微量存在；紅海棠果肉中未檢測到，夏立萌果肉中大量存在，嘎啦果肉中微量存在。根皮素葡萄糖苷/根皮素半乳糖苷除GL053-2未檢測到外，其他新疆野蘋果果肉中均可檢測到，紅海棠果肉中未檢測到，嘎啦果肉中微量存在，夏立萌中大量存在。

2.3不同樣品果肉中類黃酮含量的比較

根據(jù)所測樣品濃度確定標準品濃度范圍，最終將標準品分別配制成1 mg/L溶液，混合標準品，與樣品測試相同條件進樣，得圖2。在混合標準樣品的液相色譜圖中，綠原酸標準樣品保留時間為3.69 min，原花青素B2標準樣品保留時間為4.44 min，表兒茶素標準樣品保留時間為 5.24 min。通過樣品與混合標準樣品對比，保留時間的誤差分別為：綠原酸0.8%，原花青素B2為1.5%，表兒茶素1.5%，3種類黃酮物質(zhì)與標準樣品保留時間誤差均小于2%[21]，可以確認是同一種物質(zhì)，其他樣品中經(jīng)過比對該3種物質(zhì)，保留時間誤差同樣小于2%，因此可以確定3種物質(zhì)分別為綠原酸、原花青素B2、表兒茶素。

如表3所示，在綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的含量中，新疆野蘋果果肉比其他品種果肉含量高，如新疆野蘋果綠原酸含量最高的GL053-1是紅海棠含量的7.17倍，新疆野蘋果原花青素B2含量最高的GL026是夏立萌的109.05倍，新疆野蘋果表兒茶素含量最高的GL183是嘎啦含量的82.13倍。在25個新疆野蘋果果肉樣品中，綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的含量均在新疆野蘋果果肉平均含量以上的有6株，分別為GL026、GL030、GL053-1、GL172、GL179、GL183；綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的含量均在新疆野蘋果果肉平均含量以下的有12個，分別是GL009、GL013、GL017、GL019、GL034、GL038-2、GL039、GL095、GL112、GL170、GL176、GL181，其中GL039、GL095和GL170的綠原酸含量均低于100 μg/g； GL023果肉除了原花青素B2含量在平均含量以上，其余兩種類黃酮含量均在平均含量以下； GL028、GL038-1、GL053-2的果肉綠原酸含量均高于平均含量，其他兩種類黃酮均低于平均含量； GL129和GL173的果肉綠原酸含量均低于平均含量，原花青素B2和表兒茶素的含量均高于平均含量；GL169的果肉綠原酸和原花青素B2含量低于平均含量，表兒茶素含量高于平均含量。

3討論與結(jié)論

類黃酮屬于多酚類物質(zhì)，是果實中重要的功能性成分，高類黃酮含量的果實具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用[22-24]。新疆野蘋果是重要的蘋果野生資源，張小燕等[8]曾測定新疆野蘋果果實中多酚物質(zhì)的主要組成。本試驗測定新疆野蘋果果肉類黃酮組成成分，研究組分專一，準確性更高，測定的25個新疆野蘋果果肉樣品中共檢測到綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、對香豆?？崴?、原花青素C1、槲皮素半乳糖苷/槲皮素葡糖苷、槲皮素阿拉伯糖苷/槲皮素木糖苷、根皮素木糖葡萄糖苷、根皮素葡萄糖苷/根皮素半乳糖苷9種含量較高的類黃酮物質(zhì)，與當?shù)卦耘嗥贩N嘎啦、夏立萌及野生種紅海棠品種檢測到的組分基本一致，但類黃酮組分含量差異顯著。Mayr等[25]發(fā)現(xiàn)蘋果果肉綠原酸含量平均 20.7 mg/kg，本試驗結(jié)果表明，新疆野蘋果平均綠原酸含量為332.53 μg/g，嘎啦為72.33 μg/g，夏立萌為130.78 μg/g，新疆野蘋果果肉綠原酸含量遠高于栽培蘋果。原花青素是重要的類黃酮物質(zhì)[26]，王皎等[27]利用HPLC法測定了5個品種蘋果中原花青素B2的含量，發(fā)現(xiàn)5種蘋果果肉的原花青素B2含量在90.19～247.06 μg/g范圍內(nèi)，本試驗研究結(jié)果表明，新疆野蘋果果肉中平均原花青素B2含量為437.23 μg/g，嘎啦果肉中的含量為22.24 μg/g。乜蘭春等[28]以富士蘋果為試材，利用高效液相色譜研究了果肉表兒茶素含量為60.6 μg/g，本研究結(jié)果表明，新疆野蘋果平均表兒茶素含量為376.24 μg/g，嘎啦和夏立萌的含量分別為12.76 μg/g和12.19 μg/g。

綜上所述，利用超高效液相色譜串聯(lián)四級飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測蘋果果實果肉類黃酮物質(zhì)種類及含量，結(jié)果共檢測出9種含量較高的類黃酮物質(zhì)，與當?shù)卦耘嗥贩N嘎啦、夏立萌及野生種紅海棠檢測到的組分基本一致；經(jīng)過綠原酸、原花青素B2及表兒茶素標準品對比及定量研究，結(jié)果表明，不同植株新疆野蘋果果肉類黃酮含量存在差異，其含量基本均遠高于當?shù)卦耘喔吕?、夏立萌及紅海棠的含量。該結(jié)果有利于比較不同單株新疆野蘋果果肉類黃酮的種類和含量，篩選類黃酮組分及含量高的種質(zhì)資源，為進一步進行蘋果功能成分育種的珍貴種質(zhì)提供參考。

參考文獻：

[1]Cook N C， Samman S J. Flavonoids-chemistry， metabolism， cardioprotective effects， and dietary sources[J]. J. Nutr. Biochem.， 1996， 7（2）： 66-76.

[2]Konczak I，Zhang W. Anthocyanins—more than natures colors [J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology， 2004，5：239-240.

[3]Huang Y S， Ho S C. Polymethoxy flavones are responsible for the anti-inflammatory activity of citrus fruit peel [J]. Food Chemistry， 2010， 119（3）： 868-873.

[4]聶繼云，呂德國，李靜，等. ‘長富 2 號蘋果果實類黃酮組成和含量研究[J]. 園藝學報，2010，37（10）：1559-1566.

[5]Chen X S， Feng T， Zhang Y M， et al. Genetic diversity of volatile components in Xinjiang wild apple （Malus sieversii） [J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007，34（2）：171-179.

[6]張春雨，陳學森，林群， 等. 新疆野蘋果群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的SRAP分析 [J]. 園藝學報， 2009，36 （1）：7-14.

[7]馮濤，陳學森，張艷敏，等. 新疆野蘋果葉片抗氧化能力及多酚組分的研究 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2008，41（8）：2386-2391.

[8]張小燕，陳學森，彭勇，等. 新疆野蘋果多酚物質(zhì)的遺傳多樣性[J]. 園藝學報，2008， 35 （9）： 1351-1356.

[9]方波，趙其陽，席萬鵬，等. 十種柚類及柚雜種果實中類黃酮含量的超高效液相色譜分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2013，46（9）：1892-1902.

[10]李琨，張學杰，張德純，等. 不同芹菜品種葉與葉柄黃酮含量及其與抗氧化能力的關(guān)系[J]. 園藝學報，2011，38（1）：69-76.

[11]倪書茂，錢大瑋，尚爾鑫，等. 大川芎方化學成分的超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間質(zhì)譜分析[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2010，16（1）：39-45.

[12]鄭潔，趙其陽，張耀海，等. 超高效液相色譜法同時測定柑橘中主要酚酸和類黃酮物質(zhì)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2014，47（23）：4706-4717.

[13]Khan M L， Haslam E， Williamson M P. Structure and conformation of procyanidin B2 dimer [J]. Magn. Reson. Chem.， 1997， 35（12）： 854-858.

[14]Pods dek A，Wilska J J，Anders B，et al. Compositional characterisation of some apple varieties [J]. European Food Research and Technology， 2000， 210（4）： 268-272.

[15]Vrhovsek U，Rigo A，Tonon D，et al. Quantitation of polyphenols in different apple varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004， 52（21）： 6532-6538.

[16]Wollgast J， Pallaroni L， Agazzi M E， et al. Analysis of procyanidins in chocolate by reversed-phase high performance liquid chromatography with electrospray inoization massspectrometric and tandem mass spectrometric detection [J]. Journal of Chromatography A， 2001， 926（1）： 211-220.

[17]Lee K W，Kim Y J，Kim D O， et al. Major phenolics in apple and their contribution to the totalantioxidant capacity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003， 51（22）：6516-6520.

[18]Clifford M N， Marks S， Knight S， et al. Characterization by LC-MS（n） of four new classes of p-coumaric acid-containing diacyl chlorogenic acids in green coffee beans [J]. J. Agric. Food Chem.， 2006，54（12）：4095-4101.

[19]肖俊松，曹雁平，龔玉石，等. 青蛇果原花青素分離和低聚體純品的制備[J].食品科學，2009，30（17）：113-119.

[20]聶繼云，呂德國，李靜，等. 蘋果果實中類黃酮化合物的研究進展[J]. 園藝學報，2009， 36（9）：1390-1397.

[21]夏敦嶺.冬棗果皮色素穩(wěn)定性研究及其黃酮類成分定性定量分析[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2006.

[22]Dhiman A， Ahmad S， Nanda A， et al. In vitro antimicrobial status of methanolic extract of Citrus sinensis Linn. fruit peel [J]. Chronicles of Young Scientists， 2012， 3： 204-208.

[23]Cesar T B， Aptekmann N P， Araujo M P， et al. Orange juice decreases low-density lipoprotein cholesterol in hypercholesterolemic subjects and improves lipid transfer to high-density lipoprotein in normal and hypercholesterolemic subjects[J]. Nutrition Research， 2010， 30： 689-694.

[24]凌關(guān)庭.有“第七類營養(yǎng)素”之稱的多酚類物質(zhì)[J].中國食品添加劑，2000 （1）：29-36.

[25]Mayr U， Michalek S， Treutter D， et al. Phenolic compounds of apple and their relationship to scab resistance [J]. Journal of Phytopathology， 1997，145（2/3）：69-75.

[26]Yang J Y， Li Y， Wang F， et al. Hepatoprotective effects of apple polyphenols on CCl4-induced acute liver damage in mice [J]. J. Agric. Food Chem.， 2010， 58（10）： 6525-6531

[27]王皎，宋新波，劉成航，等. HPLC法測定不同品種蘋果中原花青素B2的含量[J].食品科學， 2012，33（24）：293-295.

[28]乜蘭春， 孫建設(shè).蘋果果實酚類物質(zhì)含量與果實苦澀關(guān)系的研究[J]. 園藝學報，2005，32 （5）： 778-782.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學2017，49（3）：52～57Shandong Agricultural Sciences