陶一明，胡寬，湯參娥，馮鐵誠，王志明

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1． 肝臟外科 2． 醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008）

BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白7（BTB/POZ domaincontaining protein 7，BTBD7）基因定位染色體14q32.12，是迄今發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的癌基因，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管塑形的潛在重要功能，是肝細(xì)胞癌（HCC）新的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和預(yù)后標(biāo)志物[1]。BTBD7的假基因（pseudogene）1、2（BTBD7P1、BTBD7P2）分別定位染色體10p13和10q25，其序列與BTBD7呈高度同源性，為高度保守的非編碼序列，屬于長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[2]。近年來研究[3-4]表明，假基因和lncRNA在腫瘤中存在異常表達(dá)，并且在腫瘤發(fā)生過程中有重要的調(diào)控作用。筆者通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測HCC患者組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)BTBD7P2在HCC組織中少見表達(dá)，BTBD7P1在HCC組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)，通過其表達(dá)水平與HCC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析，BTBD7P1可能在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過構(gòu)建BTBD7P1的慢病毒過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞系Bel7404，檢測轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞BTBD7 mRNA、蛋白水平以及細(xì)胞增殖的影響。旨在為研究發(fā)現(xiàn)HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)新基因提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　HCC組織標(biāo)本

HCC組織樣本共106例，為2009—2010年間于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院肝臟外科行手術(shù)切除的HCC患者，均已被告知并簽署書面知情同意書。本課題研究內(nèi)容已報(bào)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批備案，同意實(shí)施。HCC確診根據(jù)2010年版世界衛(wèi)生組織（WHO）病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2　細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

HCC細(xì)胞系Bel7404購自美國保藏物中心（ATCC），生長于含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、青霉素（10萬U/L）和鏈霉素（10萬U/L）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

1.3　SYBR熒光染料法定量PCR

PCR引物堿基對(duì)序列采用美國哈佛大學(xué)引物數(shù)據(jù)庫Primer Bank（http://pga.mgh. harvard.edu/primer bank）在線設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物約100～250 bp大小，經(jīng)Blast程序比對(duì)確定引物的特異性后，由大連TaKaRa生物技術(shù)公司合成。取TRIzol?Reagent（美國Thermo公司）提取新鮮HCC組織總RNA，測定濃度后合成cDNA 用于PCR擴(kuò)增，用△△Ct以來計(jì)量表示該樣本中目的基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)。目的基因序列見表1。

1.4　慢病毒載體pLKO.1-BTBD7P1過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司完成，根據(jù)BTBD7P1基因序列，合成其基因過表達(dá)序列；重組病毒包裝、收集和病毒濃縮液滴度檢測具體方法參照文獻(xiàn)。得到病毒濃縮液，檢測滴度約為1×109TU/mL。分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1　定量PCR擴(kuò)增基因序列Table 2 Oligonucleotide sequences of specific primers for quantitative real-time PCR

1.5　慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bel7404細(xì)胞

選擇Bel7404細(xì)胞為轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞[1]。分為兩組：⑴ 轉(zhuǎn)染LV-BTBD7P1的Bel7404細(xì)胞組（Bel7404LV-BTBD7P1）；⑵ 轉(zhuǎn)染空載體的Bel7404細(xì)胞（Bel7404LV-Control）作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟參照文獻(xiàn)[5]。

1.6　MTT法檢測Bel7404細(xì)胞增殖抑制率

Bel7404細(xì)胞轉(zhuǎn)染BTBD7P1過表達(dá)質(zhì)粒和空載體后觀察細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)操作步驟參照文獻(xiàn)[1]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7　Western blot檢測BTBD7的表達(dá)

胰酶消化離心轉(zhuǎn)染后的Bel7404細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌，800 r/min，離心2次收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白質(zhì)濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉液實(shí)驗(yàn)操作步驟參照文獻(xiàn)。BTBD7抗體工作濃度為1:1 000。Bio-Rad Scan軟件計(jì)算條帶的灰度值和內(nèi)參α-tubulin灰度值的作為蛋白表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

圖1　定量PCR檢測BTBD7P1與BTBD7P2的表達(dá)Figure 1 BTBD7P1 and BTBD7P2 expressions detected by real time PCR

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié) 果

2.1　HCC組織中BTBD7P1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)

106例配對(duì)HCC組織中BTBD7P1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于鄰近癌旁肝組織中的表達(dá)水平[（0.71±0.16） vs.（ 2.14±1.44），P＜0.05]；HCC組織及癌旁肝組織中少見BTBD7P2 mRNA表達(dá)（圖1）。

2.2　BTBD7P1表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)癌組織中BTBD7P1相對(duì)表達(dá)量低于癌旁肝組織2倍為標(biāo)準(zhǔn)分為低表達(dá)和高表達(dá)。BTBD7P1低表達(dá)與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、分化程度、靜脈血管侵犯、出血壞死和HCC分期有關(guān)（均P＜0.05）（表2）。

2.3　BTBD7P1 mRNA表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系

本組BTBD7P1 mRNA高表達(dá)患者1、3、5年總體生存率分別為93%、74%、53%，BTBD7P1 mRNA低表達(dá)患者1、3、5年總體生存率分別為77%、44%、18%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BTBD7P1 mRNA高表達(dá)患者1、3、5年無瘤生存率分別為74%、57%、38%，BTBD7P1 mRNA低表達(dá)患者1、3、5年無瘤生存率分別為22%、12%、5%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

表2　BTBD7P1 mRNA表達(dá)與HCC臨床病理特征相的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of BTBD7P1 mRNA expression with clinicopathologic characteristics of HCC [n (%)]

圖2　不同BTBD7P1 mRNA表達(dá)水平患者生存情況比較 A：總體生存曲線；B：無瘤生存曲線Figure 2 Comparison of the survival conditions between patients with different BTBD7P1 mRNA expression levels A: Overall survival curves; B: Tumor-free survival curves

2.4　過表達(dá)BTBD7P1抑制HCC細(xì)胞增殖

活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測Bel7404細(xì)胞增殖的變化（圖3）。轉(zhuǎn)染LV-BTBD7P1的Bel7404細(xì)胞組（Bel7404LV-BTBD7P1）與對(duì)照組細(xì)胞（Bel7404LV-Control）比較，細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。

2.5　BTBD7P1抑制HCC細(xì)胞的BTBD7 mRNA表達(dá)

通過RT-PCR方法檢測Bel7404LV-BTBD7P1和Bel7404LV-Control細(xì)胞中BTBD7 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Bel7404LV-BTBD7P1細(xì)胞中BTBD7 mRNA表達(dá)水平較Bel7404LV-Control細(xì)胞明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖4）。通過Western blot檢測兩組細(xì)胞中BTBD7蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞BTBD7蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖5）。

圖3　MTT檢測結(jié)果Figure 3 Results of MTT assay

圖4　BTBD7 mRNA表達(dá)檢測Figure 4 Measurement of BTBD7 mRNA expression

圖5　BTBD7蛋白表達(dá)檢測Figure 5 Measurement of BTBD7 protein expression

3　討 論

HCC是我國常見惡性腫瘤之一。進(jìn)一步探索研究新基因的功能與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，對(duì)揭示HCC發(fā)生、發(fā)展的精確分子機(jī)制、設(shè)計(jì)合理的治療藥物及判斷預(yù)后，進(jìn)一步提高我國HCC的治療水平具有重要意義。

BTBD7基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控關(guān)鍵基因，定位于人類染色體14q32.12區(qū)域，約1 233 bp大小，其結(jié)構(gòu)中包括BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，CAAT增強(qiáng)蛋白β（C/EBP-β），GATA和AP-1轉(zhuǎn)錄子位點(diǎn)[6]。BTBD7首次被發(fā)現(xiàn)是因其可引導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生“分支形態(tài)”（branching morphogenesis）改變過程中發(fā)揮了重要作用[7]。已有的研究[8]顯示，BTBD7基因也稱FUP1，最先是從肝臟細(xì)胞中克隆發(fā)現(xiàn)被鑒定，其在肝臟組織表達(dá)有相對(duì)特異性，并被證實(shí)在HCC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。筆者[1]前期研究中證實(shí)：BTBD7表達(dá)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型，并激活下游RhoC-ROCK2-FAK通路信號(hào)，促使HCC細(xì)胞分泌較多的基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）。目前調(diào)控BTBD7表達(dá)研究鮮見報(bào)道。

新近研究[9]表明，假基因異常表達(dá)可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用。部分假基因?qū)ζ涔δ芑蛴姓{(diào)節(jié)作用[10]。而且特異性假基因表達(dá)可作為腫瘤的預(yù)測因子，諸如AOC4P[11]、OCT4[12]、INTS6P1[13]等。目前關(guān)于BTBD7假基因（BTBD7P1和BTBD7P2）在HCC及其他惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在HCC患者組織中的BTBD7P1表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，臨床病理相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)BTBD7P1低表達(dá)水平與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，提示BTBD7P1的表達(dá)水平與HCC的發(fā)生可能存在一定關(guān)系。目前BTBD7P1在HCC表達(dá)下調(diào)的原因尚不清楚，可能涉及缺氧微環(huán)境的調(diào)節(jié)[14]或表觀遺傳調(diào)控機(jī)制[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)BTBD7P1可抑制親本基因BTBD7 mRNA的表達(dá)，但對(duì)BTBD7蛋白表達(dá)無影響，提示BTBD7P1可能扮演了內(nèi)源性小RNA（esiRNA）[16]或內(nèi)源性競爭環(huán)狀RNA（ceRNA）重要角色[17]。BTBD7P1具有與親本功能基因BTBD7編碼的蛋白質(zhì)一樣的功能，即抑制HCC細(xì)胞生長。說明BTBD7P1不需要通過BTBD7蛋白發(fā)揮作用，但具體調(diào)控機(jī)理尚有待進(jìn)一步探索。已有研究證據(jù)表明，假基因可通過競爭性地結(jié)合miRNA調(diào)控功能基因的表達(dá)，從而抑制或者促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。提示上述作用分子機(jī)制可能是BTBD7 mRNA及BTBD7P1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物競爭某同一種或幾種microRNA，激活不同信號(hào)通路發(fā)揮功能得以實(shí)現(xiàn)，其中哪些是起決定性因素的microRNA調(diào)節(jié)或者可能參與的信號(hào)途徑值得進(jìn)一步深入研究[19-20]。

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