王 丹 黃 琦

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高血糖大鼠腎臟Nrf2及NQO1表達(dá)的影響*

王 丹1黃 琦2#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

目的：探討人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高血糖大鼠腎臟轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nr f2)及醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase l，NQO1）表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（NC組，n=8）和糖尿病模型組（n=40）。高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型組大鼠2周后用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，之后隨機(jī)分為穩(wěn)定高糖組（SH組，n=8）和波動(dòng)性高糖組（FH組，n=32），F(xiàn)H組錯(cuò)時(shí)注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動(dòng)大鼠模型。2周后，將FH組隨機(jī)分為4組，分別是低劑量組（LG組），中劑量組（MG組），高劑量組（HG組）及波動(dòng)性高糖組（BG組），予人參皂苷低中高劑量（14、28、56mg/(kg·d)）干預(yù)相對(duì)應(yīng)的模型組8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后切取腎臟組織，用western blot和RTPCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)檢測(cè)Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果：與NC組相比，SH組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），與SH組相比，BG組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），與BG組相比，人參皂苷治療組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：人參皂苷能夠進(jìn)一步促進(jìn)波動(dòng)性高糖狀態(tài)下Nr f2及NQO1蛋白及mRNA表達(dá)，通過增加NQO1的含量，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，保護(hù)波動(dòng)性高血糖所致的腎臟損傷。

人參皂苷 波動(dòng)性高血糖 轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 醌氧化還原酶1 氧化應(yīng)激 大鼠

糖尿病腎臟病變是糖尿病患者常見的慢性微血管并發(fā)癥，近年來研究發(fā)現(xiàn)，血糖波動(dòng)與糖尿病血管并發(fā)癥有著密切的關(guān)系[1]，可能在糖尿病腎病中發(fā)揮了一定的作用。在生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)可以正常調(diào)節(jié)空腹血糖及餐后血糖，使其維持在正常水平，而糖尿病患者由于胰島素的缺乏或者分泌不足，血糖往往波動(dòng)較大，與穩(wěn)定性高血糖相比，波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病患者腎臟的危害性更大[2]，但其導(dǎo)致的糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但氧化應(yīng)激似乎在腎臟損傷過程中起著重要作用。人參皂苷作為人參的提取物，可抗氧化及清除機(jī)體內(nèi)自由基[3]。因此，它可能在治療糖尿病腎病中起到一定作用。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nr f2)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，它通過與應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合，激活下游各種細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，包括血紅素加氧酶-1（HO-1），NQO1醌氧化還原酶1（NQO1），從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷作用[4]。研究表明，在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，ARE/Nr f2通路的活性會(huì)增加[5]。因此，通過上調(diào)ARE/Nr f2信號(hào)通路，提高其下游抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，可能作為治療糖尿病腎病的一種方法。本實(shí)驗(yàn)用人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高血糖所致腎臟損傷的大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察腎臟組織中Nr f2和NQO1的蛋白及基因的表達(dá)，旨在探討人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高血糖所致的腎臟損傷的治療作用及其保護(hù)機(jī)制，從而為人參皂苷的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器:人參皂苷粉末(浙江省中醫(yī)院自制，制劑批準(zhǔn)號(hào):201308190)；超短效胰島素諾和銳(丹麥諾和銳)；鏈尿佐菌素(Sigma公司)；自制高脂飼料:蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎(chǔ)飼料69.5%；NQO1和Nr f2引物(Takara公司)；兔抗NQO1多克隆抗體和兔抗Nr f2多克隆抗體(CST公司)；RT-PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司）；Trizol裂解液（Invit rogen公司）；血糖試紙及血糖儀(德國(guó)羅氏)；Step one plus PCR儀（美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司）。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備:6～8周齡SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量160～180g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬)2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK(浙)2008-0115]。48只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、穩(wěn)定性高糖組(SH組)、波動(dòng)性高糖組（BG組）、人參皂苷低劑量組（LG組）、人參皂苷中劑量組（MG組）、人參皂苷高劑量組（HG組），每組8只。除正常對(duì)照組使用正常飼料喂養(yǎng)外，其余各組均使用高脂飼料喂養(yǎng)2周后禁食不禁水16小時(shí)，用小劑量STZ 35mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，禁食不禁水16h，測(cè)空腹血糖15～20mmol/L為模型制作成功。NC組給予腹腔注射生理鹽水0.375g/(kg·d)體質(zhì)量作為對(duì)照，SH組定時(shí)給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/(kg·d)。BG組、LG組、MG組、HG組予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/(kg·d)，錯(cuò)時(shí)30min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成一天中血糖值大幅度波動(dòng)模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復(fù)漂移，注射后30min測(cè)血糖，制作波動(dòng)性高血糖模型，連續(xù)6周，血糖波動(dòng)幅度＞1SD為有效波動(dòng)。LG組、MG組、HG組分別予人參皂苷（14、56mg/kg/d）灌胃，BG組予等量生理鹽水灌胃8周作對(duì)照，每日2次。

1.3 標(biāo)本采集:每周用血糖儀測(cè)尾尖血血糖，稱其體質(zhì)量，并計(jì)算水和食物的攝入量。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠禁食12小時(shí)，切取腎臟組織，放入液氮罐中保存，用于western blot及RT-PCR檢測(cè)。

1.4 western blot檢測(cè)NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)水平:從液氮罐中取出腎臟組織，放入液氮預(yù)冷過的研缽中，加入蛋白酶抑制劑+裂解液（1∶100）適量，研磨至液體澄清；吸取全部液體放入離心管中，12000rpm，4℃，離心15min，提取細(xì)胞總蛋白；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度；吸取蛋白樣品，以60V電壓電泳，當(dāng)條帶跑至分離膠和濃縮膠分界面時(shí)改為90V電泳，時(shí)間2～4h；PVDF轉(zhuǎn)膜（250MA，2.5h）；將PVDE膜浸于封閉液中，4℃封閉過夜；取出膜，與一抗接觸，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～3h，用TBST沖洗3次，同樣的方法二抗室溫孵育1～2h后，TBST洗3次；加入ECL試劑，將PVDF膜放在Chemi Doc XRS上采集圖像。以β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的對(duì)比表示蛋白的表達(dá)量。

1.5 RT-PCR檢測(cè)NQO1和Nr f2mRNA表達(dá):由基因庫(kù)查的所需mRNA的核苷酸序列，PrimerPremier計(jì)算機(jī)軟件輔助引物設(shè)計(jì)，引物由TakaRa公司設(shè)計(jì)并合成。, Nr f2上下游引物分別為:5’-TGTAGTGCGAGGAAGAGGTATGA-3′和5’-GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG-3′，NQO1上下游引物分別為:5’-ATTGTGCTTGTGAGGGTGTTTC-3′和5’-CCCTTCCTGTCTTTTCTTCTCTCT-3′。從液氮中取出腎臟組織冰上迅速研碎后，用Trizol法提取總RNA；吸取1μl抽提的RNA在Nanodropl000上進(jìn)行RNA濃度測(cè)定，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的完整性；取RNA按照逆轉(zhuǎn)錄體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA 2μl及Nr f2和NQO1上下游引物各0.4μl，SYBRPremix Ex TaqTM（2×）10μl，Rox Reference Dye II（50×）0.4μl，滅菌雙蒸水6.8μl（擴(kuò)增條件為:95℃、5min，94℃、1min，57℃、1min，72℃、1min，32個(gè)循環(huán)后，72℃8min。2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后置于Bio-Rad Gel凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。）

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane＇sT2。以P＜0.05差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷對(duì)Nr f2和NQO1蛋白的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，SH組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與SH組相比，BG組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）；與BG組相比，LG、MG、HG組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，低、中、高劑量組NQO1及Nr f2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。(圖1～2)

圖1 各組大鼠腎臟Nr f2及NQO1蛋白的表達(dá)

圖2 各組大鼠腎臟Nr f2及NQO1蛋白的表達(dá)量

2.2 人參皂苷對(duì)NQO1和Nr f2 mRNA的表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，SH組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）；與SH組相比，BG組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）；與BG組相比，LG、MG、HG組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，低、中、高劑量組NQO1及Nr f2 mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟NQO1及Nr f2基因的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SH組及BG組Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于NC組，但BG組Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于SH組，說明在生理狀態(tài)下，其表達(dá)量較低，但在引起氧化應(yīng)激的因素誘導(dǎo)下如高血糖可誘導(dǎo)其顯著表達(dá)。雖然血糖升高刺激Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)增加，但其并不能對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)波動(dòng)性高血糖大鼠腎臟的損傷。較穩(wěn)定性高血糖，波動(dòng)性高血糖的慢性并發(fā)癥的發(fā)病率更高，而且出現(xiàn)的時(shí)間越早，慢性并發(fā)癥越高，這與氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷的增加有著密切的關(guān)系。

人參素有“百草之王”“神草”等稱號(hào)，《神農(nóng)本草經(jīng)》把人參列為上品，味甘，微寒，“主補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、除邪氣、明目、開心益智、久服輕身延年”功效。人參作為補(bǔ)虛中藥的第一要藥，治療“消渴”早有記載。《傷寒論》第222條記載，“渴欲飲水，口干舌燥者，白虎加人參湯主之”。糖尿病屬“消渴”范疇，其病機(jī)主要在于陰精虧虛，燥熱偏勝，故以清熱潤(rùn)燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹委煷蠓ā，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人參皂苷是其主要活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高免疫力、降血糖等作用[6-8]。在該實(shí)驗(yàn)中，人參皂苷有效上調(diào)了大鼠腎臟內(nèi)Nr f2和NQO1的表達(dá)。Nr f2被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化應(yīng)激作用，當(dāng)受到外界氧化刺激時(shí)，Nr f2從Keap-1中解離，通過與ARE結(jié)合，并參與下游II相代謝酶基因和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)NQO1的表達(dá)[9]。Nr f2的激活可以誘導(dǎo)NQO1的表達(dá)，抗氧化蛋白含量增加，提高了機(jī)體的抗氧化反應(yīng)能力。

綜上所述，NQO1是細(xì)胞內(nèi)的一種保護(hù)性還原酶，可減少外界物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，本文研究顯示人參皂苷可通過上調(diào)Nr f2和NQO1基因和蛋白的表達(dá)，減緩波動(dòng)性高糖所致氧化應(yīng)激對(duì)腎臟功能的損害，其機(jī)制可能是通過激動(dòng)Nr f2/ARE信號(hào)通路啟動(dòng)該抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在臨床上，現(xiàn)有的治療及研究很難從根源上徹底逆轉(zhuǎn)胰島β細(xì)胞功能的障礙和凋亡，而作為傳統(tǒng)中藥人參的提取物，人參皂苷發(fā)揮了其自身優(yōu)勢(shì)，為應(yīng)用于糖尿病腎臟病變的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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2016-07-06

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目人參皂苷通過Nr f2/ARE信號(hào)通路干預(yù)波動(dòng)性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究，編號(hào)：2014ZA045

# 通訊作者：黃 琦，E-mail：hq871201@163.com