王瑋玨，董武軍，張培成，蘇倩倩，范茹涵，劉玉玲#（.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點實驗室，北京 00050；.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 00050；.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 45000）

黃芩素中有關(guān)物質(zhì)的檢測及其降解機制初步研究Δ

王瑋玨1＊，董武軍1，張培成2，蘇倩倩1，范茹涵3，劉玉玲1#（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450001）

目的：建立黃芩素中有關(guān)物質(zhì)的分離檢測方法，鑒定其結(jié)構(gòu)并初步探討降解機制。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）檢測黃芩素與合成過程中的有關(guān)雜質(zhì)及強制破壞降解產(chǎn)物：色譜柱為ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl，流動相為0.3%甲酸-甲醇-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為275 nm，柱溫為10℃，進樣量為10 μL。采用LC-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定有關(guān)物質(zhì)并推測降解機制：色譜柱為ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl，流動相為0.3%甲酸-甲醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為275 nm，柱溫為10℃，進樣量為10 μL；離子源為電噴霧離子源，正負離子同時檢測，霧化器壓力為55 psi，干燥氣體流速為11 L/min，干燥氣體溫度為350℃，毛細管電壓為4.0 kV，檢測模式為全掃描一級質(zhì)譜和選擇離子全掃描二級質(zhì)譜，掃描范圍為m/ z 100～1 000（一級質(zhì)譜），50～500（二級質(zhì)譜），電離電壓為80～135 eV，碰撞能量為10～30 eV。結(jié)果：黃芩素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.4～480 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；定量限、檢測限分別為7.2、2.4 ng。黃芩素與有關(guān)物質(zhì)及3個主要降解產(chǎn)物分離良好，有關(guān)物質(zhì)為化學(xué)合成前體木蝴蝶素；堿降解產(chǎn)物為6，7位鄰醌衍生物和7，8位鄰醌衍生物，兩者互為異構(gòu)體；氧化降解產(chǎn)物為苯甲酸苯酯類衍生物。結(jié)論：黃芩素堿降解和氧化降解的主要機制包括吡喃環(huán)開環(huán)、互變重排和氧化反應(yīng)等；該研究所建方法專屬性好、靈敏度高，可用于黃芩素有關(guān)物質(zhì)的分離檢測。

黃芩素；有關(guān)物質(zhì)；降解機制；高效液相色譜法；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

黃芩素（Baicalein，BE）是黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，分子式為C15H10O5，化學(xué)名為5，6，7-三羥基黃酮（5，6，7-Trihydroxyflavone），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，黃芩素具有顯著的抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝、保護神經(jīng)元等藥理作用[1-4]，含有黃芩素成分的中藥制劑在臨床上已被廣泛用于治療細菌或病毒引起的急慢性腸炎、痢疾、上呼吸道感染、急慢性結(jié)膜炎等。但受溶解度低、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等理化性質(zhì)限制，黃芩素單一成分至今未能成藥。

圖1 黃芩素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of baicalein

黃芩素屬多羥基黃酮，分子結(jié)構(gòu)中含有三個羥基，在溶液狀態(tài)尤其是堿性條件下極易發(fā)生化學(xué)降解，降解機制復(fù)雜。含有酚羥基的黃酮易被氧化為醌類衍生物，由于降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的特殊性，且通常為系列降解產(chǎn)物，高效液相色譜法（HPLC）常用的C18、C8、苯基、腈基、氨基等色譜柱往往難以對降解產(chǎn)物進行有效分離與檢測。文獻采用HPLC考察黃芩素在不同pH的Krebs-Ringer試液中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在pH 6.0、6.8、7.4條件下藥物含量均顯著降低，但該報道未對降解產(chǎn)物進行測定[5]。另有文獻通過紫外光譜研究光照、溫度、pH及抗氧化劑對黃芩素穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)在光照和堿性條件下黃芩素溶液的吸光度值顯著下降，其含量明顯降低，但該文獻亦未對黃芩素降解產(chǎn)物進行分離檢測和結(jié)構(gòu)鑒定[6]。有研究報道了黃芩素原料藥有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法，但最終僅鑒定檢測了千層紙素A，未能提供黃芩素的降解情況及降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息[7]。本課題組曾參考文獻[7]方法對黃芩素有關(guān)物質(zhì)進行考察，發(fā)現(xiàn)堿破壞降解產(chǎn)物多、峰形差且堆積在溶劑峰后，難以有效分離，無法滿足有關(guān)物質(zhì)測定要求。

雖然普遍認(rèn)為黃酮類化合物的降解產(chǎn)物多為醌類結(jié)構(gòu)[8-9]，但關(guān)于黃芩素的降解產(chǎn)物類型及其結(jié)構(gòu)至今尚不清楚。而關(guān)于黃芩素系列降解產(chǎn)物的有效分離與檢測，國內(nèi)外亦均未見文獻報道，這在一定程度上影響了黃芩素制劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用。本課題組以全合成的黃芩素為試驗樣品，擬通過優(yōu)化HPLC色譜條件，實現(xiàn)黃芩素與工藝雜質(zhì)及破壞降解產(chǎn)物的有效分離；并進一步結(jié)合二極管陣列（DAD）紫外光譜分析和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）一級、二級質(zhì)譜信息收集，對降解產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定，由此推測黃芩素降解機制，為后續(xù)的黃芩素制劑研發(fā)提供準(zhǔn)確、科學(xué)的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀（包括DAD檢測器、自動進樣器、柱溫箱）、1200型LC-6410型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（包括DAD二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子源、三重四級桿質(zhì)譜儀）均購自美國Agilent公司；XS105 Dual Range型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

黃芩素原料藥（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自制，批號：HJ73）；黃芩素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111595-200905，純度：98.5%）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取黃芩素對照品12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取黃芩素原料藥12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.3 強制破壞樣品溶液 精密稱取黃芩素原料藥60 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，作為貯備液，備用。①酸破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸1 mL，30℃水浴加熱30 min，再加甲醇定容，搖勻，即得。②堿破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 ml量瓶中，加0.01 mol/L氫氧化鈉0.5 mL，30℃水浴加熱20 min，加0.01 mol/L鹽酸0.5 mL中和，再加甲醇定容，搖勻，即得。③氧化破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加10%過氧化氫1 mL，30℃水浴加熱30 min，再加甲醇定容，搖勻，即得。④高溫破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，置于80℃烘箱中加熱24 h，冷卻后加甲醇定容，搖勻，即得。⑤光照破壞樣品溶液：精密量取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，于（4 500±500）lx強光下照射24 h，再加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2 有關(guān)物質(zhì)分離檢測

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）-乙腈（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：10℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

2.2.2 專屬性試驗 分別量取“2.1”項下供試品溶液和強制破壞樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果表明，樣品在各強制降解條件下產(chǎn)生的主要降解產(chǎn)物與黃芩素分離良好，主要降解產(chǎn)物之間均有效分離，分離度均＞1.5，理論板數(shù)均≥10 000，表明本方法專屬性良好，能夠?qū)⒔到猱a(chǎn)物有效分離，滿足有關(guān)物質(zhì)測定要求。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芩素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.4、4.8、24、48、120、240、480 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芩素質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得黃芩素回歸方程為y＝56.42x－24.37（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，黃芩素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.4～480 μg/mL。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.2.4 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察 取“2.2.3”項下質(zhì)量濃度為24 μg/mL的對照品溶液，逐級稀釋，精密量取各級對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ為7.2 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD為2.4 ng。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.3”項下質(zhì)量濃度為240 μg/mL對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩素峰面積的RSD＝1.4%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液、“2.2.3”項下質(zhì)量濃度為240 μg/mL對照品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品、對照品溶液中黃芩素峰面積的RSD分別為1.5%、1.4%（n＝5），表明供試品、對照品溶液未產(chǎn)生新的雜質(zhì)，溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取黃芩素對照品適量，加甲醇制成含量為100%的供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩素峰面積的RSD＝1.3%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 樣品中雜質(zhì)的測定 精密稱取黃芩素原料藥12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液；精密量取上述供試品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。分別精密量取上述供試品溶液、對照品溶液各10 μL，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量。結(jié)果表明，黃芩素原料藥中單個最大雜質(zhì)的含量為2.08%，總雜質(zhì)含量為2.37%。

2.2.9 有關(guān)物質(zhì)來源分析及紫外光譜測定 由圖2可知，黃芩素強制破壞樣品中主要有4個雜質(zhì)，其保留時間分別為11.5、12.6、15.4、27.0 min，依次命名為雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4。在酸破壞和光照破壞條件下，黃芩素未產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，表明其對酸、光照的穩(wěn)定性良好；黃芩素在堿破壞和高溫破壞條件下主要形成雜質(zhì)1、雜質(zhì)2，氧化破壞主要形成雜質(zhì)3，表明堿、氧化條件對黃芩素穩(wěn)定性的影響最為顯著；在各強制破壞條件下，雜質(zhì)4的含量均未見明顯改變，推測該雜質(zhì)可能為合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。

取“2.1”項下供試品溶液、強制破壞樣品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件（檢測波長為200～400 nm）連續(xù)進樣測定6次，記錄DAD吸收曲線，詳見圖3。結(jié)果，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3的紫外光譜形態(tài)和最大吸收均與黃芩素有明顯差異，表明其共軛骨架結(jié)構(gòu)與黃芩素不同；而雜質(zhì)4具有典型的黃酮化合物紫外光譜特征，且與黃芩素相似，表明其化學(xué)結(jié)構(gòu)與黃芩素相近。

圖3 DAD吸收曲線Fig 3 DAD absorption spectrum

2.3 有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定及降解機制推測

2.3.1 LC-MS/MS條件 ①色譜條件。色譜柱：ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：10℃；進樣量：10 μL。該色譜條件下獲得的色譜與“2.2”項下的HPLC色譜一致性良好。②質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），正負離子同時檢測；霧化器壓力：55 psi；干燥氣體流速：11 L/min；干燥氣體溫度：350℃；毛細管電壓：4.0 kV；檢測模式：全掃描一級質(zhì)譜（Scan）和選擇離子全掃描二級質(zhì)譜；掃描范圍m/z一級質(zhì)譜100～1 000，二級質(zhì)譜50～500；電離電壓：80～135 eV；碰撞能量：10～30 eV。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Program of gradient elution

2.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定和降解機制推測 黃芩素在堿、氧化條件下的降解最為顯著，因此分別量取“2.1.3”項下堿破壞、氧化破壞樣品溶液各適量，按“2.3.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜、總離子流（TIC），詳見圖4、圖5。

圖4 堿破壞樣品的圖譜Fig 4 Atlas of samples destroyed by alkaline

圖5 氧化破壞樣品的圖譜Fig 5 Atlas of samples destroyed by oxidation

由圖4、圖5可知，在LC-MS/MS系統(tǒng)中，黃芩素主峰及主要雜質(zhì)的保留時間、出峰順序與HPLC系統(tǒng)基本一致。通過TIC圖提取與雜質(zhì)1～4對應(yīng)的一級質(zhì)譜和二級碎片信息，鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)并分析降解機制。各雜質(zhì)的一級、二級質(zhì)譜分別見圖6、圖7。

雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的一級質(zhì)譜高度相似（如圖6A和B所示），均可觀察到m/z 171、210、241、267[M-H-H2O]－、285[M-H]－，可知雜質(zhì)1、雜質(zhì)2的分子量為286。雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的母離子（m/z 285）產(chǎn)生的二級碎片（-ESI）分別如圖7A和B所示，由285[M-H]－脫去H2O產(chǎn)生碎片m/z 267，再脫去CO產(chǎn)生m/z 239，碎片質(zhì)量數(shù)和相對豐度基本相同，故推測二者是同分異構(gòu)體。黃芩素的分子量為270，此分子量286比黃芩素多16，可能是1個氧原子，結(jié)合DAD吸收曲線可知，二者的紫外光譜只有一個吸收峰，表明不具有黃酮母體共軛結(jié)構(gòu)，雜質(zhì)1和雜質(zhì)2可能的結(jié)構(gòu)、裂解途徑見圖8。由于化合物的保留時間與極性相關(guān)，在反相HPLC中雜質(zhì)2的保留時間比雜質(zhì)1大，表明雜質(zhì)2的極性較小，推測雜質(zhì)2是分子偶極較小的7，8位鄰醌式結(jié)構(gòu)，而雜質(zhì)1是分子偶極較大的6，7位鄰醌式結(jié)構(gòu)，二者是一對異構(gòu)體。

圖6 雜質(zhì)的一級質(zhì)譜圖Fig 6 First-order MS of impurities

圖7 雜質(zhì)的二級質(zhì)譜圖Fig 7 Second-order MS of impurities

圖8 黃芩素堿降解機制及雜質(zhì)1、雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)、裂解途徑Fig 8 Alkaline degradation mechanism of baicalein and structures and fragmentation pathways of impurity 1，impurity 2

雜質(zhì)1和雜質(zhì)2是黃芩素的堿降解產(chǎn)物，據(jù)此推測堿降解機制為在堿性條件下，黃芩素C環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生類似查爾酮的中間結(jié)構(gòu)，通過Wessely-Moser重排反應(yīng)[10，11]生成互變異構(gòu)體，同時A環(huán)羥基在空氣中氧的作用下氧化成醌，生成雜質(zhì)1和雜質(zhì)2。

雜質(zhì)3的一級質(zhì)譜（+ESI）如圖6 C所示，可觀察到m/z 247[M+H]+、269[M+Na]+，故分子量為246。雜質(zhì)3母離子（m/z 247）的二級碎片如圖7 C所示，由m/z 247脫去H2O產(chǎn)生碎片m/z 229，再依次脫去CO產(chǎn)生碎片m/z 201 [M+H-H2O-CO]+和m/z 173[M+H-H2O-2CO]+。雜質(zhì)3的DAD吸收曲線有2個吸收峰，與黃芩素相比，其最大吸收波長發(fā)生藍移，表明雜質(zhì)3共軛鏈縮短，可能不具有黃酮母核結(jié)構(gòu)，其可能的結(jié)構(gòu)和裂解過程見圖9。

圖9 黃芩素氧化降解機制及雜質(zhì)3的結(jié)構(gòu)、裂解途徑Fig 9 Oxidative degradation mechanism of baicalein and structure and fragmentation pathway of impurity 3

雜質(zhì)3由黃芩素氧化降解產(chǎn)生，推測氧化降解機制為在過氧化氫作用下，黃芩素的C環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，A環(huán)脫去羥基，2，3位碳-碳雙鍵被氧化，產(chǎn)生苯甲酸苯酯類產(chǎn)物。

雜質(zhì)4的一級質(zhì)譜（+ESI）如圖6D所示，可觀察到m/z 285[M+H]+、307[M+Na]+，故分子量為284；其母離子（m/z 285）的二級質(zhì)譜如圖7D所示，由m/z 285脫去CH3產(chǎn)生m/z 270，再通過逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)（RDA）裂解產(chǎn)生m/z 168，m/z 168丟失CO產(chǎn)生碎片離子m/z 140，因此可確定雜質(zhì)4含有甲氧基[12]，推測為黃芩素A環(huán)羥基被甲氧基取代的黃酮類化合物；雜質(zhì)4的紫外吸收光譜與文獻報道的木蝴蝶素一致[13]，結(jié)合原料藥合成工藝路線[14]，推測雜質(zhì)4是黃芩素的化學(xué)合成前體——木蝴蝶素，其結(jié)構(gòu)及可能的裂解過程見圖10。

圖10 雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)、裂解途徑Fig 10 Structure and fragmentation pathway of impurity 4

3 討論

黃酮類化合物化學(xué)降解機制復(fù)雜，采用不同降解條件所得的產(chǎn)物不同，鑒定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)困難，文獻報道黃芩素易被氧化為醌類衍生物而顯綠色[15]，但黃芩素在不同條件下降解所得的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和降解機制至今尚不清楚。本研究通過HPLC-DAD、LC-MS/MS對黃芩素強制降解產(chǎn)物進行分析和結(jié)構(gòu)鑒定，并以此推測其降解機制，結(jié)果表明：（1）在堿性條件下，黃芩素吡喃環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，經(jīng)Wessely-Moser反應(yīng)互變重排成異構(gòu)體，同時A環(huán)酚羥基經(jīng)空氣氧化，降解產(chǎn)生6，7位鄰醌類結(jié)構(gòu)（雜質(zhì)1）和7，8位鄰醌類結(jié)構(gòu)（雜質(zhì)2），兩者為互變異構(gòu)體。（2）在氧化條件下，黃芩素吡喃環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，2，3位雙鍵在過氧化氫作用下氧化斷裂，產(chǎn)生苯甲酸苯酯類結(jié)構(gòu)（雜質(zhì)3）。

本研究在HPLC法色譜條件優(yōu)化中，考察了不同鍵合相填料的色譜柱，包括C18、C8、苯基、腈基、氨基、苯基己基和氟苯基柱，以及不同柱溫（10～40℃）對分離檢測結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含苯基鍵合相的色譜柱及低溫有利于降解產(chǎn)物分離，不僅實現(xiàn)了主成分與工藝雜質(zhì)及降解產(chǎn)物的分離，還實現(xiàn)了醌類降解產(chǎn)物及其互變異構(gòu)體的相互分離；而其他色譜填料，黃芩素堿降解產(chǎn)物易堆積在溶劑峰后且峰形較差。推測原因，可能是由于醌類降解產(chǎn)物及其互變異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子極性都極為相近，而氟苯基色譜柱同時具有疏水作用、π-π電子相互作用及偶極誘導(dǎo)作用，對芳香和雜環(huán)化合物、共軛體系及異構(gòu)體等產(chǎn)生獨特的分離機制，更有利于降解產(chǎn)物分離。因此，最終采用FluoroSep-RP Phenyl（FSP）氟苯基色譜柱，在柱溫10℃進行有關(guān)物質(zhì)檢測分離。

本研究建立的HPLC法，能夠有效分離檢測黃芩素合成過程中的工藝雜質(zhì)及系列降解產(chǎn)物，在此基礎(chǔ)上，對其主要降解產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，推測了其降解機制。研究結(jié)果不僅為黃芩素制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量控制提供了重要分析方法，同時對黃酮類化合物的有關(guān)物質(zhì)及降解機制研究具有一定指導(dǎo)意義。

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Detection of Related Substances and Preliminary Study on the Degradation Mechanism of Baicalein

WANG Weijue1，DONG Wujun1，ZHANG Peicheng2，SU Qianqian1，F(xiàn)AN Ruhan3，LIU Yuling1（1.Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulation，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；2.State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicines，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；3.School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the separation and detection of related substances in baicalein，identify itsstructure and preliminarily explore the degradation mechanism.METHODS：HPLC was adopted to detect the baicalein，related impurities and forced destruction of degradation products in synthesis process：the column was ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3%formic acid-methanol-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，the column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL.LC-MS/MS was conducted to identify the related substances and conjecture degradation mechanism：the column was ES Industries?FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3% formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL；ion source was electrospray ion source，positive and negative ions，nebulizer pressure was 55 psi and the drying gas flow was 11 L/min，drying gas temperature was 350℃，capillary voltage was 4.0 kV，detection modes were full-scan first-order MS and selective ion full-scan second-order MS，scan ranges were m/z 100-1 000（first-order MS）and 50-500（second-order MS），ionization voltage was 80-135 eV，and the collision energy was 10-30 eV.RESULTS：The linear range of baicalein was 2.4-480 μg/mL（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the limit of quantitation was 7.2 ng，the limit of detection was 2.4 ng.Baicalein was well separated with related substance and 3 major degradation products，the related substance was chemical synthesis precursor wood butterfly；the degradation products were 6，7-quinone derivatives and 7，8-quinone derivatives，which were isomers；oxidative degradation products were benzoic acid phenyl ester derivatives.CONCLUSIONS：The main mechanisms of alkali degradation and oxidative degradation of baicalein include pyran，reciprocal rearrangement and oxidation reaction；the established method is specific and sensitive，and can be used for the detection of related substances in baicalein.

Baicalein；Related substance；Degradation mechanism；HPLC；LC-MS/MS

R927

A

1001-0408（2017）06-0803-06

2016-04-27

2016-06-30）

（編輯：張 靜）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No.2012ZX09301002-001-008）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項“創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)與新技術(shù)專項”（No.2012CHX03）

＊碩士研究生。研究方向：納米給藥系統(tǒng)。電話：010-83160332。E-mail：doggiejue@163.com

#通信作者：研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：新型微粒載體構(gòu)建及腫瘤靶向制劑等。電話：010-63159373。E-mail：ylliu@imm.ac.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.23