楊文方 王加麗 張彤 金曦 李文靜 李丹陽(yáng) 王翔 黨曦虹 張昌寧

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝的關(guān)鍵酶，主要功能是將5，10-亞甲基四氫葉酸不可逆還原為5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸作為體內(nèi)甲基的主要供體，參與體內(nèi)嘌呤、嘧啶、DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化修飾。MTHFR cDNA上677位堿基C->T變異可促進(jìn)該酶分解為單體及輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的解離，進(jìn)而導(dǎo)致MTHFR催化活性下降，致使體內(nèi)葉酸的活性形式即5-甲基四氫葉酸生成減少，從而影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)等各種重要大分子的甲基化修飾，導(dǎo)致甲基化程度異常，最終影響胚胎發(fā)育[1]；另一方面，由于5-甲基四氫葉酸生成減少，導(dǎo)致Hcy轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸過(guò)程出現(xiàn)障礙，使血漿Hcy水平異常升高，因而是神經(jīng)管畸形、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等疾病的重要危險(xiǎn)遺傳因素[2]。目前MTHFR多態(tài)性和葉酸關(guān)系是近些年研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)已有人群中MTHFR多態(tài)性的報(bào)道[3]。本研究旨在采用穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均較高的PCR-芯片法分析西安地區(qū)MTHFRC677T位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布情況，同時(shí)和中國(guó)其他地區(qū)進(jìn)行比較，進(jìn)而為出生缺陷一級(jí)預(yù)防策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：依據(jù)知情同意原則，隨機(jī)抽取2013年6月—2016年2月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行孕前或早孕檢查的漢族孕齡健康女性，排除DNA提取不合格者，有效入組對(duì)象共1 966例，年齡18～43歲，平均(28.6±3.9)歲。

2.基因測(cè)定：DNA的提取抽取患者外周靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，即時(shí)提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)提取DNA后，存放于-20 ℃冰箱用作下一步實(shí)驗(yàn)。MTHFR基因型測(cè)定采用PCR-芯片雜交顯色試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)檢測(cè)MTHFR基因型。

PCR擴(kuò)增引物序列如下：上游5′-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3′和下游5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反應(yīng)體系25 μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200 μmol/L、正反引物各0.5 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5 μg。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，末次延伸5 min。取10 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雜交顯色，然后用芯片識(shí)讀儀讀取患者基因型。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0軟件。考慮到多重檢驗(yàn)可能增加犯一類錯(cuò)誤的概率，本研究利用R語(yǔ)言通過(guò)FDR法(false discovery rate)校正P值。采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析不同地域省份經(jīng)度、緯度和突變等位基因頻率的相關(guān)性。利用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis法分析南北方地區(qū)的突變型等位基因頻率的差異。采用χ2檢驗(yàn)比較本研究和北方總體和南方總體等位基因頻率的差異。不同區(qū)域的聚類分析采用系統(tǒng)聚類法和K-means聚類法進(jìn)行。P<0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.采用PCR-芯片法對(duì)MTHFRC677T分型結(jié)果及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)：采用芯片法可清晰地檢測(cè)出樣本MTHFRC677T位點(diǎn)3種基因型。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，芯片上前三列是樣品DNA質(zhì)量的質(zhì)控點(diǎn)，且每種基因型都有平行重復(fù)(如第一行4、5和6點(diǎn)代表C基因型)和其交叉重復(fù)(如第二行7，8和9位置)，見圖1。Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)顯示，三種基因型的P均>0.05，提示所選本遺傳平衡，具有一定的地區(qū)代表性。

圖1 MTHFR C677T基因分型結(jié)果 A、B、C依次表示基因型CC、CT和TT

2.西安漢族女性MTHFR基因多態(tài)性分布及南北方比較：西安地區(qū)漢族孕齡女性MTHFRC677T位點(diǎn)突變型T的頻率為53.3%。同時(shí)選取已經(jīng)報(bào)道的北方6個(gè)地區(qū)(包括黑龍江、山東、河南、河北、天津、陜西)和已經(jīng)報(bào)道的南方9個(gè)地區(qū)(包括江蘇、湖北、四川、云南、湖南、江西、廣西、廣東、海南)的MTHFRC677T基因型的分布，由于同一省份不同地域基因型分布很接近，將這些數(shù)據(jù)合并計(jì)算該地區(qū)的分布頻率，見表1。西安地區(qū)突變的T等位基因的頻率和之前報(bào)道結(jié)果類似(53.3%和54.3%)，說(shuō)明該研究人群的選擇具有代表性。北方地區(qū)內(nèi)部(χ2=81.570，P<0.001)和南方地區(qū)內(nèi)部(χ2=363.214，P<0.001)突變型T等位基因頻率的分布各自存在明顯的異質(zhì)性，因此，采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis法對(duì)我國(guó)北方和南方地區(qū)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)北方地區(qū)的突變型T等位基因頻率顯著高于南方地區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。本研究中MTHFRC677T位點(diǎn)突變型T的頻率為53.3%，與北方6個(gè)地區(qū)平均突變頻率57.7%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.398，P=0.528)，但是卻明顯高于南方9個(gè)地區(qū)的平均突變頻率33.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.344，P=0.007)。

突變型T等位基因與緯度、經(jīng)度的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，該突變型T等位基因的分布頻率與我國(guó)各地區(qū)的平均經(jīng)度無(wú)相關(guān)性(r=0.471，P=0.065)；但是，該突變型T等位基因的分布頻率與我國(guó)各地區(qū)的平均緯度卻呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.868，P<0.001)。我國(guó)北方地區(qū)MTHFRC677T突變型T等位基因的頻率明顯高于南方，并隨著地域緯度的增加而顯著性升高,見表2。頻率最低出現(xiàn)在南方的海南，但最高地區(qū)卻出現(xiàn)在北方的山東，而不是緯度最高的黑龍江，提示除了緯度因素外，可能還有其他因素影響著該位點(diǎn)的突變頻率分布。西安地區(qū)與北方的黑龍江、天津的頻率分布均無(wú)差異，但低于北方的山東、河南、河北這些緯度較高地區(qū)，而又均顯著高于緯度較低地的南方9個(gè)地區(qū)。

3.不同區(qū)域MTHFRC677T聚類分析：采用系統(tǒng)聚類法分析不同區(qū)域MTHFRC677T基因型分布關(guān)系，表明本研究結(jié)果和天津、陜西、黑龍江關(guān)系最為接近。而北方地區(qū)可明顯聚成一類，南方地區(qū)聚為另一類，進(jìn)一步說(shuō)明MTHFRC677T基因型頻率的分布在我國(guó)存在南北區(qū)域差異，見圖2。

對(duì)各地域的基因型構(gòu)成比數(shù)據(jù)，同時(shí)采用K-means聚類法進(jìn)行分析。根據(jù)系統(tǒng)聚類法結(jié)果，將指定分類數(shù)目k設(shè)置為2，迭代次數(shù)設(shè)置為100。最終，K-means分析結(jié)果與系統(tǒng)聚類法結(jié)果一致，提示南方9個(gè)地區(qū)聚類為1組(T等位基因頻率聚類重心為0.337)，北方6個(gè)地區(qū)和本研究聚類為2組(T等位基因頻率聚類重心為0.571)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.758，P<0.001)，見表3。

表1 不同地區(qū)漢族孕齡女性MTHFR C677T基因型和等位基因頻率比較

注：不同地區(qū)漢族孕齡女性MTHFRC677T基因型和等位基因頻率比較,*P<0.05

表2 突變型T等位基因與緯度、經(jīng)度的相關(guān)性分析

注：突變型T等位基因頻率分布與緯度正相關(guān)，r=0.868，*P<0.001；與經(jīng)度無(wú)相關(guān)性，P=0.065

圖2 MTHFR C677T基因型在我國(guó)15個(gè)地域的系統(tǒng)聚類分析

案例號(hào)區(qū)域聚類距離北方1本研究200382黑龍江200063山東200604河南200315河北200066天津200267陜西20028南方8江蘇100989湖北1006610四川1002311云南1002612湖南1001313江西1002014廣東1005215廣西1009516海南10097

注：F=67.758，P<0.001

討論

出生缺陷是我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。西安地區(qū)的出生缺陷率在7.9‰～9.3%[12-13]，根據(jù)西安市統(tǒng)計(jì)學(xué)年鑒報(bào)道近些年新增新生兒在8.2萬(wàn)左右，這意味著每年大概有648～760名先天性畸形兒出生，其中先天性心臟病、總唇裂和神經(jīng)管缺陷是最主要的出生缺陷類型。目前遺傳因素是出生缺陷的重要影響因素，目前研究比較多的基因是MTHFR，尤其是其mRNA序列上C677T的突變可導(dǎo)致高度保守的丙氨酸變成纈氨酸。突變型的MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致葉酸代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致甲基化異常和血漿Hcy水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致出生缺陷如神經(jīng)管缺陷[14]、先天性心臟病[15]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。而且，MTHFRC677T的突變還會(huì)顯著增加早期妊娠丟失的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因多態(tài)性分布存在地域特異性[17]。早在2003年就西安地區(qū)人群中MTHFR 677T多態(tài)性分布的報(bào)道[18]，但納入樣本僅有96名，難以反映MTHFR的基因型分布特征。本研究隨機(jī)抽樣并分析1 966名西安漢族健康孕齡女性MTHFRC677T基因多態(tài)性的分布特征，納入人群基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明抽樣人群有很好的代表性。在和已報(bào)道省份數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T的等位基因頻率分布和地理緯度有明顯的關(guān)系，突變基因型T的頻率從山東(63.1%)到最低的海南(24.0%)，和緯度呈明顯地正相關(guān)，這和我國(guó)神經(jīng)管缺陷發(fā)病率北高南低的事實(shí)是相符的[19]。

由于不同地區(qū)人群的遺傳背景存在一定差異，因此出生缺陷一級(jí)預(yù)防策略的制定應(yīng)該因地制宜、因人而異，改變和完善目前全國(guó)統(tǒng)一推行的一級(jí)預(yù)防干預(yù)模式。目前國(guó)家衛(wèi)計(jì)委推薦預(yù)防出生缺陷的措施是在孕前3個(gè)月至孕早期3個(gè)月每日補(bǔ)充葉酸0.4 mg。但在補(bǔ)充相同劑量的葉酸2個(gè)月后，MTHFRC677T位點(diǎn)TT型孕婦血漿葉酸水平會(huì)顯著升高，而同型半胱氨酸明顯下降，但依然高于CC型孕婦[20]，提示著葉酸補(bǔ)充還應(yīng)考慮遺傳多態(tài)性的影響。通過(guò)開展MTHFR的分子流行病學(xué)研究，了解不同地區(qū)人群的遺傳特征，進(jìn)而為完善出生缺陷一級(jí)預(yù)防措施提供科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MTHFRC677T的等位基因頻率分布和地理緯度有明顯的關(guān)系，突變基因型T的頻率在我國(guó)從南向北逐漸增高?？紤]到T突變基因型在我國(guó)北方人群中分布頻率比較密集，超過(guò)50%，且該基因型葉酸利用率較低，相同劑量的葉酸補(bǔ)充干預(yù)，該基因型需要更長(zhǎng)的時(shí)間達(dá)到預(yù)防出生缺陷的體內(nèi)微環(huán)境負(fù)荷量。因此，在出生缺陷的葉酸預(yù)防劑量上，在我國(guó)北方地區(qū)提高干預(yù)劑量，將有可能獲得更理想的一級(jí)預(yù)防效果。

1 Yamada K,Chen Z,Rozen R,et al.Effects of common polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate reductase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98:14853-14858.

2 Nazki FH,Sameer AS,Ganaie BA.Folate:metabolism,genes,polymorphisms and the associated diseases.Gene,2014,533:11-20.

3 Yang B,Liu Y,Li Y,et al.Geographical distribution of MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in China:findings from 15357 adults of Han nationality.PloS one,2013,8:e57917.

4 馬路密,魯衍強(qiáng),李瑛,等.尚志市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性調(diào)查.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2015,22:289-291.

5 高峽,魯衍強(qiáng),馬少杰,等.張家口地區(qū)漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2014:35-37.

6 李俊華,魯衍強(qiáng),馬少杰,等.廊坊市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分析.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2014,34:1564-1565.

7 羅秀莉,魯衍強(qiáng),郭文竹,等.湖北松滋市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,25:29-32.

8 王維鵬,魯衍強(qiáng),芮欣憶,等.湖北省漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性分布研究.中國(guó)婦幼保健,2013,28:140-143.

9 王淑媛,魯衍強(qiáng),馬少杰,等.湘潭市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布及其與血漿Hcy水平的關(guān)系.天津醫(yī)藥,2014,12:1205-1208,1209.

10 方園,魯衍強(qiáng),薛琰,等.九江市漢族女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率分布與其他地區(qū)漢族女性的比較.中國(guó)婦幼保健,2015,30:1732-1735.

11 沈寅琛,魯衍強(qiáng),李瑛,等.南寧地區(qū)漢族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性研究.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2015,7:18-19,56.

12 張水平,宋曉彬,周引榮,等.西安市2003～2008年圍產(chǎn)兒出生缺陷調(diào)查研究.中國(guó)婦幼健康研究,2009,20:550-555.

13 張水平,梁艷,劉淑芳,等.圍產(chǎn)兒42 272名出生缺陷分析.中國(guó)兒童保健雜志,2004,12:259-261.

14 Yang Y,Chen J,Wang B,et al.Association between MTHFR C677T polymorphism and neural tube defect risks:A comprehensive evaluation in three groups of NTD patients,mothers,and fathers.Birth defects research Part A,Clinical and molecular teratology,2015,103:488-500.

15 Chen KH,Chen LL,Li WG,et al.Maternal MTHFR C677T polymorphism and congenital heart defect risk in the Chinese Han population:a meta-analysis.Genetics and molecular research :GMR,2013,12:6212-6219.

16 楊文方,樊靜,李丹陽(yáng),等.亞甲基四氫葉酸還原酶多態(tài)性與早期妊娠丟失風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究.中國(guó)婦幼健康研究,2015,26:1128-1130.

17 李進(jìn)華,胡華梁,范松麗,等.河北省漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶與甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性.中國(guó)生育健康雜志,2015,26:219-222.

18 孫文萍,萬(wàn)琪,蘇明權(quán).西安地區(qū)漢族亞甲基四氫葉酸還原酶的兩種基因多態(tài)性.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24:634-636.

19 代禮,朱軍,周光萱,等.1996～2000年全國(guó)神經(jīng)管缺陷的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè).中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2002,36:402-405.

20 張爽,魯衍強(qiáng),芮欣憶,等.不同5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型人群葉酸補(bǔ)服效果評(píng)價(jià).天津醫(yī)藥,2013:628-631.