劉燕++孫學(xué)明++鄒曉琳

摘 要：主要研究?jī)?nèi)容為通過對(duì)最佳反應(yīng)總體系、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行探索，建立用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)土壤中典型腸道病原菌的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)主要目的是通過不對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得大量的單鏈DNA，為用基因芯片方法檢測(cè)土壤中的典型腸道病原菌做準(zhǔn)備。應(yīng)用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記后，與寡核苷酸基因芯片進(jìn)行雜交，可以提高雜交效率。

關(guān)鍵詞：不對(duì)稱PCR 土壤 典型病原菌

中圖分類號(hào)：X17 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2016）11（b）-0062-02

不對(duì)稱PCR是指反應(yīng)體系中兩條濃度不一樣的引物，在PCR擴(kuò)增的后期，當(dāng)其中量少的一條引物被消耗完以后，另一條繼續(xù)以線性擴(kuò)增的方式，產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈 DNA。部隊(duì)稱PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)可以應(yīng)用的范圍相對(duì)較為廣泛：如配合RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)研究真核DNA外顯子、制備單鏈探針、DNA序列分析等，在寡核苷酸基因芯片的檢測(cè)應(yīng)用方面，不對(duì)稱PCR在標(biāo)記單鏈樣品方面比常規(guī)PCR更有優(yōu)勢(shì)，與寡核苷酸芯片雜交效率也較高。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

研磨過篩（20目），-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及試劑盒

主要試劑及試劑盒：引物、dNTP、50 bp DNA Ladder，100 bp DNA Ladder、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖、FastDNASPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。

1.3 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），PTC-100 PCR儀（MJ Research，Waltham，MA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取儀（Biospec products，USA），DYY-8B型電泳儀（北京市六一儀器廠）FastPrepTM FP120核酸提取儀（Bio 101，Carlsbad，USA），高速離心機(jī)（上海安亭）。

1.4 DNA提取

利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒與Mini-BeadBeater-16TM核酸提取儀提取土壤DNA。主要過程參見FastDNASPIN Kit for Soil試劑盒。

1.5 引物合成

參照文獻(xiàn)[1-2]合成引物：UP1：GAAGTCATCATGACCGT

TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，P2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT

CNGTCAT（R指的是A或者G，Y指的是C或者T，N代表任何堿基）。

1.6 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

0.5×TBE緩沖液，6×上樣緩沖溶液，1%（w/v）瓊脂糖凝膠，200 V恒壓，電泳25～35 min。

2 結(jié)果與分析

引物的濃度比up1∶up2r依次為：1∶1、5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、75∶1和100∶1。從圖1可以看出：當(dāng)引物濃度比為5∶1時(shí)產(chǎn)生的單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物條帶比較微弱，隨著下游引物的濃度（10∶1、25∶1和50∶1）進(jìn)一步減小，有較多的單鏈DNA條帶產(chǎn)生。

以上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1～7為模板，進(jìn)行新一輪的PCR擴(kuò)增，以獲得更多的單鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。從圖2中可以看出：泳道1～3無任何的雙鏈DNA條帶產(chǎn)生，泳道4有微弱的單鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶產(chǎn)生，泳道5～6有大量的單鏈DNA條帶產(chǎn)生，泳道7擴(kuò)增產(chǎn)物條帶則開始減弱直至消失。主要原因是不對(duì)稱PCR線性擴(kuò)增階段是在前半程擴(kuò)增所產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，雙鏈產(chǎn)物的量過少易導(dǎo)致最終生成的單鏈產(chǎn)物也較少[3]，且指數(shù)擴(kuò)增階段太短。

3 結(jié)語(yǔ)

土壤中具有代表性的腸道病原菌用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)的最佳反應(yīng)條件經(jīng)驗(yàn)證為：總體系25 μL，其中10×PCR 緩沖液2.5 μL，25 mmol/L Mg2+1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，引物UP1∶UP2r為50∶1或75∶1，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O補(bǔ)足體系。最佳PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃，5 min（95 ℃，1 min；68.4℃，1 min；72℃，2 min）35輪循環(huán)，72 ℃，10 min。

參考文獻(xiàn)

[1]Gyllensten U B，Erlich H A.Nationl Instistutes of Health[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（20）：7652-7656.

[2]Tankouo-Sandjong B，A Sessitsh，E Liebana，et al.MLST-v，multilocus sequence typing based on virulence genes，for molecular typing of Salmonella enterica subsp.enterica serovars[J].Journal of Microbiological Methods，2007（69）：23-36.

[3]孔德明，蔣海燕，沈含煦，等.分子信標(biāo)用于不對(duì)稱PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2005，24（2）：7-10.