余慧宏，宋建新，黃潔瓊

(景德鎮(zhèn)市疾病預防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

日常沙門菌血清分型思路于一次盲樣考核中的應用

余慧宏，宋建新，黃潔瓊

(景德鎮(zhèn)市疾病預防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

目的 通過梳理日常沙門菌血清分型思路及總結積累的經驗，借以探討考核樣本中沙門菌血清分型方法。方法采用GB4789.4-2010沙門菌檢驗位相變異試驗簡易平板法，作為參考方法。同時運用傳代與簡易平板法相結合的方法，以及血平板-濾紙條搭橋法進行鑒定。結果 運用傳代與簡易平板法相結合的方法和血平板-濾紙條搭橋法，一次性誘導鑒定出準確的沙門菌血清型。簡易平板法誘導三次得出菌型。結論 經過這次考核樣的檢測，提高了檢驗人員對沙門菌血清型的鑒定水平，提升了解決位相變異試驗所遇難題的能力。

盲樣考核；沙門菌；血清學分型；質量控制

室間質量評價是由專門機構采用一系列辦法，比較和評價地區(qū)間、省內或全國范圍內各實驗室的檢驗質量。近十年來，本實驗室陸續(xù)參加了不同范圍內的室間質量評價考核。對于考核盲樣中分離出，僅出現(xiàn)一相鞭毛抗原的沙門菌，應用簡易平板法[1-3]，均可一次成功誘導出另一相鞭毛抗原，繼而將簡易平板法，應用于日常工作分離的沙門菌血清型鑒定中。在實踐中發(fā)現(xiàn)，有的沙門菌須誘導三次，甚至三次以上才可成功，這樣不僅費力，而且費時。有此經驗后，為了能在考核規(guī)定時間內得出沙門菌血清型，在運用簡易平板法作為參考方法的同時，還引用了其他方法進行誘導，并順利完成沙門菌菌型鑒定，現(xiàn)將情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2016年細菌實驗室能力評價考核中，江西省疾病預防控制中心下發(fā)的，需進行病原菌檢測的一份盲樣。按照考核樣品作業(yè)指導書要求，對腸道、呼吸道病原菌分離培養(yǎng)及鑒定，須鑒定到種或型。通過分離培養(yǎng)，得到一株腸道致病菌，經鑒定為沙門菌（8：r：-）。 查閱抗原表后知，需進行位相變異試驗誘導出另一相鞭毛抗原，才能判定血清型。

1.2 主要試劑和儀器血平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；三糖鐵瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、半固體瓊脂均由青島海博試劑有限公司生產；沙門菌屬診斷血清（60種）由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供；小刀、眼科小鑷子、普通濾紙剪成10mm×15mm的長方形濾紙條均由本實驗室高壓滅菌。

1.3 方法

1.3.1 采用GB4789.4-2010沙門菌檢驗位相變異試驗簡易平板法。將半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取因子血清（Hr）1環(huán)，加在半固體平板表面，放置溫箱片刻，待血清吸收到瓊脂內，在血清部位點種待檢菌株，因誘導平板瓊脂含量少，加之新鮮配制的緣故，放入培養(yǎng)箱時，不可倒置培養(yǎng)。36℃培養(yǎng)24～48h，取形成蔓延生長的菌苔邊緣菌檢查。當凝集效價低或菌量難以達到血清學試驗要求時，出現(xiàn)不容易判讀的情況，則把遠端菌接種營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)后鑒定。未出現(xiàn)第二相鞭毛抗原，則如前所述程序再誘導一次，直至出現(xiàn)第二相鞭毛抗原。

1.3.2 傳代與簡易平板法相結合的做法將沙門菌于三糖鐵瓊脂上傳代，36℃培養(yǎng)18～24h后，刮取菌苔進行血清學試驗，未出現(xiàn)另一相鞭毛抗原，再傳代培養(yǎng)后，仍未出現(xiàn)第二相鞭毛抗原，則挑取菌苔按簡易平板法進行誘導。

1.3.3 依照文獻介紹的血平板-濾紙條搭橋法進行[4，5]。在血平板上，用小刀劃出兩條距離7～8mm的平行線，平行線均貫穿血平板，將兩平行線間的瓊脂掏出，手拿鑷子將濾紙條長邊橫跨溝槽，緊貼于兩邊瓊脂上。濾紙中央滴加已知相鞭毛抗原的診斷血清（Hr）約 50μl，刮取菌苔接種于溝槽一端的濾紙邊緣（作為原點），平板放入36℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)18～24h，取原點彼岸菌苔進行血清凝集試驗。

2 結果

簡易平板法誘導三次得出菌型，沙門菌傳代與簡易平板法相結合的做法和血平板搭橋法，一次性誘導成功，較簡易平板法提前2～3d，鑒定出準確的沙門菌血清型，為黃金海岸沙門菌（8：r：l，w）。

3 討論

盲樣考核是對檢測人員技能、實驗室內質量控制情況的一種檢驗[6-8]，要求我們注重平時的實驗室質量控制工作，如儀器的維護和檢定校準、培養(yǎng)基和診斷血清的質量控制等。診斷血清對病原菌鑒定非常關鍵，血清實則是蛋白質，需要避開引起蛋白質變性的不利因素，夏天長時間使用時，最好放置在經過冷藏的冰袋上，嚴格無菌操作，防止污染，任何混濁與顏色改變，應視為雜菌污染，不應使用。

本次盲樣考核樣品中分離出腸道病原菌沙門菌。沙門菌分類原則是以O抗原來分群，每群再以H抗原來分型[9]，大多數(shù)沙門菌是有動力的，而且多數(shù)為雙相菌，具有2個位相的沙門菌可出現(xiàn)位相變異，在一定條件下自發(fā)地出現(xiàn)相互轉變，加已知相的抗血清培養(yǎng)出另一位相的方法，簡稱為誘導，通過誘導可以確定沙門菌的血清型。近年來，本實驗室將簡易平板誘導法應用到，從業(yè)人員腸道沙門菌檢測工作中。在實際工作中體會到，有些沙門菌經多次誘導才能得出血清型，為了提高簡易平板法一次誘導成功率，總結出以下幾點注意事項：自腸道體檢標本中分離出的菌株，應立即進行誘導試驗，不能及時誘導的菌株，應暫放溫箱保存，不可放入冰箱，低溫易導致沙門菌鞭毛丟失；誘導平板應新鮮配制，這樣的誘導平板水分含量充足，有利于沙門菌鞭毛運動；診斷血清滴加量，不宜過多，否則沙門菌受抑制，不易生長。經過實踐后，一次誘導成功率得到了提高。由于簡易平板法類似于血清學單向免疫擴散法，血清和菌量的比例難以把握，因此有的菌株還是得幾次誘導才能確定血清型。

摸索影響因素過程中，查閱相關文獻。據(jù)文獻報道，無論是小倒管法、小玻管法，還是簡易平板法位相變異試驗，都存在幾次誘導才能最終鑒定出沙門菌血清型的情況，并推薦了其他實踐方法，如血平板-濾紙條搭橋誘導法、M肉湯培養(yǎng)法等[10-13]。由于盲樣考核均是有時間限定的，提示著應運用快捷、簡便的誘導方法得出準確結果。便采用簡易平板法，作為參考方法，同時運用傳代與簡易平板法相結合的方法，以及血平板-濾紙條搭橋法進行沙門菌血清型鑒定。血平板-濾紙條搭橋法是切實可行的方法，首次運用，便取得成功，給予啟示，應善于發(fā)現(xiàn)工作難點，積極努力尋求解決方法作為動力，更新知識儲備，拓寬工作思路，了解工作創(chuàng)新及前沿技術，可有效地促進提高實驗室日常檢測水平，也有利于盲樣考核檢測工作的順利完成。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.4-2010食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2012：25-44.

[2]何曉青.衛(wèi)生防疫細菌檢驗[M].南昌：新華出版社，1989：10-11，301-317.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.WS271-2007感染性腹瀉診斷標準[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：6-7.

[4]王海燕，宋曼丹，賴蔚苳，等.血平板-濾紙條搭橋法在沙門菌血清分型中的應用[J].華南預防醫(yī)學，2011，37(2)：75-77.

[5]張丹，溫應銘，賴志堅.搭橋法誘導腸炎沙門氏菌鞭毛抗原及鑒定[J].北方藥學，2015，12(9)：78-79.

[6]付冬蓮，袁國輝，賴玉珍，等.一次微生物混合考核盲樣檢測分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2012，30(6)：628-630.

[7]楊一明.微生物質控考核樣品的檢測分析與探討[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2011，8(23)：2941-2942．

[8]楊獻青，何惠娟.微生物質控盲樣菌株鑒定的檢驗思路與質量保證[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(3)：663-664．

[9]花蕾.南京市公共場所從業(yè)人員沙門菌感染狀況分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2012，30(1)：71-72.

[10]邱亞群，石曉路，李迎慧，等.M肉湯法在沙門菌血清分型中的應用[J].熱帶醫(yī)學雜志，2015，15(1)：53-55.

[11]侯水平，伍業(yè)健，張欣強，等.1種沙門菌位相變異實驗的方法學研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25(12)：1935-1940.

[12]傅丹青，孫永祥，丁水軍.營養(yǎng)瓊脂斜面法在沙門菌“H”抗原位相變異中的應用[J].預防醫(yī)學論壇，2009，15(12)：1291-1292．

[13]徐云龍，李明強，金凌.營養(yǎng)肉湯－營養(yǎng)瓊脂法在沙門菌H抗原鑒定中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，24(2)：205-206

[14]孫吉昌，游興勇，曾艷兵，等.2009年至2011年江西省食品中沙門菌污染狀況調查[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2012，30(2)：126-129.

[15]郭仲輝，陳冬雅，黎毓光，等.沙門菌的檢測及耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2013，31(1)：63-64.

R446.5，R378.2+2

A

1674-1129(2017)05-0690-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.017

2017-01-17；

2017-08-07)