余建林，彭 琳，陳娟娟，譚立明

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院檢驗(yàn)專業(yè)2011級；2、南昌大學(xué)第二臨床學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

·綜述·

結(jié)核病臨床免疫學(xué)診斷的研究進(jìn)展

余建林1，彭 琳2，陳娟娟3，譚立明3

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院檢驗(yàn)專業(yè)2011級；2、南昌大學(xué)第二臨床學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

結(jié)核病是由胞內(nèi)寄生結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染人體后引起的疾病。從被認(rèn)識到現(xiàn)在近200年，結(jié)核病的診斷方法多種多樣，由于MTB的生長特性，臨床癥狀的非特異性，肺組織的病理變化多樣性，結(jié)核病的潛伏感染（LTBI）等因素，導(dǎo)致目前很難做到早期、特異、敏感的診斷。本文通過對結(jié)核病的免疫診斷的研究作一綜述，希望有助于早期、特異、敏感地診斷結(jié)核病。

結(jié)核病；免疫學(xué)診斷；分枝桿菌

目前結(jié)核病的診斷方法有多種，但是都存在一定的缺陷：⑴痰培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)周期長，一般需要2~4周才能看到陽性結(jié)果，而確定陰性結(jié)果需要8周的時(shí)間，培養(yǎng)成功率只有80%左右。⑵痰涂片方法雖然簡單易行，但是陽性率低，容易造成漏檢，有40%以上的成人肺結(jié)核及75%肺外結(jié)核患者的臨床涂片標(biāo)本檢查為陰性，對于潛伏感染無法做出診斷。⑶結(jié)核菌素（PPD）試驗(yàn)簡便易行，但結(jié)核菌素含有多種蛋白質(zhì)成分，與多種分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，而且需要3天后才能觀察結(jié)果。結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性的人群在接種卡介苗后，PPD結(jié)果會(huì)轉(zhuǎn)為陽性；并且PPD含有多種抗原，可以是多種分枝桿菌所共有，可與其他分枝桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)[1，2]，中國人群普遍接種卡介苗，導(dǎo)致其假陽性率增加，且其結(jié)果是根據(jù)結(jié)核結(jié)節(jié)的大小來判斷陽性結(jié)果，容易受主觀因素的影響。對于免疫力低下的兒童、老年人或者感染能造成免疫缺陷的病毒如HIV的患者，容易造成假陰性。⑷PCR和核酸雜交方法雖然靈敏性較高，但是程序復(fù)雜需要專業(yè)的操作人員，高靈敏性導(dǎo)致容易出現(xiàn)假陽性。且儀器設(shè)備費(fèi)用高限制了其在臨床的應(yīng)用。⑸酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定結(jié)核分枝桿菌（ELISPOT-TB）檢測技術(shù)可以早期特異性檢測致病性結(jié)核分枝桿菌特異T淋巴細(xì)胞，但是需要分離培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞（PBMC）。對于免疫力低下，或者合并HIV感染及T淋巴細(xì)胞減少等無法準(zhǔn)確的診斷，且無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核桿菌潛伏感染（LTBI）。⑹血清學(xué)抗體免疫檢驗(yàn)技術(shù)簡便，快速，又有較高的敏感性和特異性，對結(jié)核病的診斷與鑒別具有重要的意義，但是由于人體血清中的抗體為多克隆抗體，可存在較嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性率較高。⑺血清抗原檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)早期檢測，且技術(shù)簡便快捷，雖然高特異度的抗體較難獲得，到那時(shí)基因操作技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及單克隆抗體制備技術(shù)，使得高特異性的抗體制備成為可能。

結(jié)核分枝桿菌的免疫檢測主要包括皮膚菌素試驗(yàn)，結(jié)核抗體的檢測，結(jié)核抗原的檢測，細(xì)胞因子的檢測等。

1 皮膚菌素試驗(yàn)

此方法應(yīng)用純蛋白衍生物（PPD）注射到體內(nèi)，觀察其是否會(huì)導(dǎo)致人體遲發(fā)型超敏反應(yīng)，來判定人體對MTB有無免疫力，從而判斷受試者是否曾經(jīng)感染過MTB。結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）對于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度31.6%，特異度為81.0%[3]。我國人群普遍接種了卡介苗，試驗(yàn)的假陽性率高，也降低了其檢測的特異度。結(jié)果由人觀察結(jié)節(jié)直徑的大小來判斷，存在著主觀性，容易造成漏診誤診。免疫力低下，免疫力缺陷或HIV感染者均可以影響該試驗(yàn)的敏感性。TST陽性的結(jié)果只能說明曾經(jīng)感染過MTB或接種過卡介苗，不能說明現(xiàn)在是否感染或者患有結(jié)核病，需要進(jìn)一步的檢測才能得出更準(zhǔn)確的結(jié)果。所以結(jié)核菌素試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值不大。

2 結(jié)核抗體的檢測

結(jié)核抗體的檢測原理是抗原抗體反應(yīng)，利用MTB的特異性抗原檢測體內(nèi)相應(yīng)的抗體，根據(jù)檢測抗體的滴度來判斷人體是否感染MTB。

肺結(jié)核患者的體液免疫與抗體IgG、IgM、IgA有關(guān)，在結(jié)核患者體內(nèi)能檢測特異性的結(jié)核抗體。PPD、脂阿拉伯甘露糖（LAM）、重組抗原（38kD蛋白、Ag85復(fù)合物、A60抗原等）等可作為抗原檢測抗體?；顒?dòng)性結(jié)核病患者細(xì)胞免疫受損，體液免疫亢進(jìn)，血清及其他體液中結(jié)核抗體升高，隨著治療時(shí)間的延長，血清抗體水平逐漸降低，結(jié)核抗體的檢測，可用于活動(dòng)性結(jié)核病與LTBI鑒別診斷及療效判斷。據(jù)報(bào)道LAM-IgG、38kD、BCG-IgG、PPDIgG檢測的敏感度分別是74.5%、70.9%、80.0%和83.6%；特異度分別是91.0%、99.0%、93.0%和84.0%；ELISA法測定血清結(jié)核抗體的線性范圍是0.625~5μg/ml，陰性與陽性標(biāo)本重復(fù)率分別是100%、95%，特異性為96%[4]。人體血液中抗體為多克隆抗體，用結(jié)核抗原去檢測時(shí)會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)；在剛剛治愈的結(jié)核病患者體內(nèi)含有較高濃度的結(jié)核抗體等會(huì)造成假陽性。重癥肺結(jié)核、血播散型結(jié)核病、老年患者或HIV感染者等免疫力低下，體內(nèi)的MTB抗原無法刺激機(jī)體產(chǎn)生足量的結(jié)核抗體，導(dǎo)致敏感性較低，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3 結(jié)核抗原的檢測

結(jié)核抗原的檢測原理是抗原抗體反應(yīng)的特異性，利用單克隆抗體來檢測體內(nèi)的MTB抗原，從而判斷機(jī)體是否感染MTB。

MTB的特異性蛋白抗原如L-丙氨酸脫氫酶、異丙基蘋果酸合酶、煙堿核苷磷酸酯酶，MPT64和兩個(gè)假定保守蛋白能滲透至人的胸腔積液、腹水、痰液等體液中，有助于肺外結(jié)核的診斷。MPT64抗原是結(jié)核分枝桿菌分泌時(shí)間最早、量最多，且非結(jié)核分枝桿菌不分泌[5]；且MPT64抗原檢測的敏感度，特異度分別是64.4%、99.4%[6，7]。Martin A[8]發(fā)現(xiàn)與聚合酶鏈反應(yīng)相比，MPT64檢測的敏感度和特異度分別為96.5%和100%，兩者的一致性達(dá)96.9%。對儀器系統(tǒng)法報(bào)告為陽性者，培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測法陽性率為93.62%[9]。不同方法檢測同一種抗原，同一種方法檢測不同抗原，相同抗原不同組合測定的結(jié)果敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均有不同[10，11]。檢測腦脊液早期分泌的抗原-6（ESAT-6）與培養(yǎng)基濾過蛋白-10（CFP-10）抗原敏感度分別為73.33%、86.67%，特異度為90.00%、95.00%[12]。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)的ESAT-6，其敏感性為90.48%，特異性為91.49%[13]。由前所述可知應(yīng)用檢測MPT64蛋白鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌相比于CFP-10、ESAT-6敏感度高，特異度強(qiáng)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。結(jié)核分枝桿菌抗原結(jié)合化學(xué)發(fā)光定量的檢測方法，可用于結(jié)核病的早期輔助診斷[14]。

結(jié)核抗原的檢測可以作為MTB存在的直接證據(jù)，可避免因?yàn)闄C(jī)體免疫應(yīng)答低下，導(dǎo)致抗體檢測或者細(xì)胞檢測假陰性。

4 細(xì)胞因子的檢測

結(jié)核免疫以細(xì)胞免疫為主，巨噬細(xì)胞在控制、殺滅MTB中起到重要作用，其抗菌活性受到多種細(xì)胞因子(CK)的調(diào)節(jié)。Th1型細(xì)胞因子能激活單核巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗菌能力，對MTB感染起到保護(hù)性免疫應(yīng)答作用，有利于疾病的控制。Th2型細(xì)胞因子抑制細(xì)胞免疫，降低了巨噬細(xì)胞的抗菌能力，使結(jié)核病的免疫應(yīng)答減弱，促進(jìn)了疾病的發(fā)展。目前認(rèn)為IFN-γ、IL-12是促進(jìn)Th1分化的主要因子；IL-4、IL-10是促進(jìn)Th2細(xì)胞分化的主要因子。巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后，產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子譜系：IL-1、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-4。結(jié)核肉芽腫形成是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子效應(yīng)過程，參與的細(xì)胞因子有IL-1、IL-8、IL-12、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-I）、促黑激素釋放抑制因子（MIF）、TGF-β、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、生長因子集落刺激因子（GF-CSF）等[15]。特異性T細(xì)胞被激活增殖分泌的IFN-γ在細(xì)胞免疫中起著重要的作用，可以將巨噬細(xì)胞激活為吞噬細(xì)胞并破壞細(xì)菌[16]。IL-21能夠增強(qiáng)CD8T細(xì)胞，促進(jìn)肺部T細(xì)胞聚集，增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。

細(xì)胞因子的檢測方法有多種，如γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）是以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因RD1區(qū)編碼抗原ESAT-6和CFP-10肽段為刺激原，體外檢測致敏T淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素，I-GRAs能夠準(zhǔn)確的判斷潛伏性的結(jié)核感染，特異度和靈敏度明顯高于膠體金法(TB-Ab)、痰涂片抗酸染色鏡檢及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TB-PCR)檢測，不受卡介苗的影響，對肺內(nèi)外檢測具有同樣的準(zhǔn)確度[1，18-21]；T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)具有較高的敏感度和特異度[19，22-24]，以ESAT-6和CFP-10肽段為刺激原，刺激結(jié)核感染者外周血單核細(xì)胞中存在特異的活化T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)而應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）方法檢測對MTB反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，對結(jié)核感染進(jìn)行診斷。IGRAs檢測敏感性90.9%，特異性為88.5%；T-SPOT.TB檢測敏感性93.2%，特異性為92.3%[25]。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液（CF）組分存在PPD、Rv1818c、Rv3812、Rv3018c或合成肽[26]。RD1抗原促進(jìn)IFN-γ的釋放[27]，且在活動(dòng)性結(jié)核與LTBI血漿中有顯著差異[28]，同時(shí)血液中的IFN-γ和IL-2濃度隨著治療的時(shí)間延長及病情的康復(fù)逐步地升高[29]。故IFN-γ在結(jié)核病的診斷中具有很好的應(yīng)用前景，然而研究證實(shí)體外干擾素γ釋放試驗(yàn)，不能用于LTBI較高的地區(qū)的活動(dòng)性結(jié)核病的鑒別診斷[30]。

5 結(jié)語

影響LTBI傳染的因素主要是遺傳基因、機(jī)體免疫系統(tǒng)、周圍環(huán)境、影響機(jī)體免疫力的疾病等。痰陽性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者是主要的傳染源，但是LTBI是結(jié)核分枝桿菌的潛在載體，LTBI在感染后的一段時(shí)間內(nèi)，由于機(jī)體的免疫力發(fā)生變化而發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。HIV感染、化學(xué)治療、類固醇激素的治療等，導(dǎo)致LTBI更容易發(fā)展為活動(dòng)性的肺結(jié)核[27，31，32]。

在結(jié)核病的防治中，重要的任務(wù)是活動(dòng)性肺結(jié)核和LTBI的診斷、治療同步進(jìn)行。需要具有特異的診斷方法能夠鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核、LTBI、卡介苗的接種。

目前結(jié)核病的檢測存在一些問題：IFN-γ不適用于判斷結(jié)核病的嚴(yán)重程度或疾病進(jìn)展情況，陽性對照結(jié)果有時(shí)不會(huì)出現(xiàn)，IFN-γ對活動(dòng)性結(jié)核病靈敏度不佳，特別是在感染HIV病毒的患者，陰性結(jié)果不能排除活動(dòng)性結(jié)核病。干擾素釋放實(shí)驗(yàn)不能區(qū)分LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病[33]，其可能的原因是：抗原的免疫原性不強(qiáng)，不能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生足夠的IFN-γ；細(xì)胞對于免疫原不夠敏感，需要其他的細(xì)胞因子加強(qiáng)細(xì)胞的敏感性和活性增加IFN-γ的釋放量。

為提高M(jìn)TB的檢出率，可從以下幾方面進(jìn)行改進(jìn)，如原理不同的幾種試驗(yàn)方法的聯(lián)合使用，抗原的免疫原性的提高，細(xì)胞因子和蛋白抗原聯(lián)合檢測等方面。免疫磁珠捕獲聯(lián)合雙內(nèi)標(biāo)聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測結(jié)核桿菌技術(shù)（IMC-PCR-ELISA）特異度和敏感度均很高[34]。IFN-γ和IL-10可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌肽的MHC-II復(fù)合物形成[35]，在檢測IFN-γ的同時(shí)，可以檢測其他的細(xì)胞因子如IL-2[35]，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，可提高檢測的敏感度和特異性，同時(shí)也可以鑒別出活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI。在檢測結(jié)核分枝桿菌抗原如MPT64[6]、ESAT-6與CFP-10[12]等，可以結(jié)合IFN-γ的檢測。對于IGRAs陽性結(jié)果不明顯的現(xiàn)象，可以加入一些具有協(xié)同作用的細(xì)胞因子如B7與CD28或者選擇其他的刺激原來提高IFN-γ的釋放。

提高M(jìn)TB檢測的敏感性可以從以下幾個(gè)方面：⑴標(biāo)本的選擇，如腦脊液因?yàn)榈鞍踪|(zhì)類的物質(zhì)相對比較少，交叉反應(yīng)或者干擾物質(zhì)較少，使得其檢測結(jié)果的敏感度和特異度均較高；而在血清中因?yàn)榭贵w或者其他的物質(zhì)相對較多，存在的干擾較嚴(yán)重；⑵檢測方法的選擇，例如MPT64的檢測，不同的檢測方法具有不同的靈敏度和特異度[6，8，10]，敏感性不好，可能是方法選擇得欠佳；⑶抗體的選擇，可以選擇高特異性、高純度的抗體；⑷標(biāo)本的處理，恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本處理方法可以減少干擾物質(zhì)，如使用層析或者差速離心等方法選擇合適分子量的物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)。

綜上所述，結(jié)核病的免疫學(xué)診斷方法具有敏感性高，特異性強(qiáng)，方法簡便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但目前也有不足之處，筆者認(rèn)為可以從前面所述的改進(jìn)方法來提高免疫學(xué)診斷的靈敏度和特異度，使其能夠更好地為臨床診斷和治療服務(wù)

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R446.62，R378.91+1

A

1674-1129(2017)01-0056-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.017

2016-07-05；

2016-11-18)

國家自然科學(xué)基金青年基金（81401964）；江西省青年科學(xué)基金（20142BAB215058）；江西省教育廳青年基金（GJJ14185）

余建林，男，1990年生，本科；彭琳，女，1994年生，本科。通信作者：陳娟娟，1983年生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：moonlikecj@163.com；譚立明，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，教授，1963年生，Email：wangxzlj@126.com