張孝歡，周 玉

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)及相關(guān)研究進(jìn)展

張孝歡1，2，周 玉2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

組織活檢是目前癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是腫瘤基因分型的一種方法，但由于腫瘤的異質(zhì)性和疾病的進(jìn)展，組織活檢對(duì)腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后、治療和基因分型的監(jiān)測(cè)有一定的局限性，因此需要一種更優(yōu)化的檢測(cè)方法?；谘獫{循環(huán)腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA，ctDNA)的液體活檢對(duì)基因突變的篩查具有高敏感性和特異性，可持續(xù)動(dòng)態(tài)觀測(cè)腫瘤的進(jìn)展。利用ctDNA的檢測(cè)能準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤的基因突變，有利于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，還能準(zhǔn)確判斷腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后及協(xié)助靶向治療。

ctDNA；腫瘤；生物標(biāo)志物；檢測(cè)方法

1 概述

1.1 循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 的發(fā)展史 1948年科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)，1997年，研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者的循環(huán)游離DNA明顯高于正?；颊遊1]。17年后，人們才發(fā)現(xiàn)這些DNA來自腫瘤，并含有腫瘤的標(biāo)志性突變。最開始，循環(huán)DNA的實(shí)際應(yīng)用并不在癌癥領(lǐng)域，而是在產(chǎn)前診斷。Lo等[2]推測(cè)胎兒DNA能夠進(jìn)入血液，并于1997年向人們成功展示，孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。這讓無創(chuàng)產(chǎn)前診斷成為可能，是產(chǎn)前診斷的一次革命。癌癥研究晚于產(chǎn)前診斷，這是因?yàn)槟[瘤DNA比胎兒DNA更難檢測(cè)，而且早期的測(cè)序技術(shù)還不夠準(zhǔn)確可靠。近10年，隨著第二代測(cè)序技術(shù)(Next-Generation Sequencing，NGS)的到來，大大提高了ctDNA檢測(cè)靈敏度和特異性，使得ctDNA檢測(cè)在臨床研究及應(yīng)用中起到重要的作用[3，4]。同時(shí)ctDNA 可以做為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的有效工具，目前有關(guān)ctDNA在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中對(duì)于腫瘤輔助診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的相關(guān)科研成果已被相繼報(bào)道[5～8]。

1.2 ctDNA的生物學(xué)特點(diǎn) ctDNA是存在于血漿或血清中的單或雙鏈DNA。早期研究表明 ctDNA具有許多癌癥相關(guān)的分子特性，如單核苷酸突變、甲基化改變和病毒基因整合入原癌基因激活的腫瘤突變，因此有研究者推測(cè)其來源于腫瘤組織。近年來，ctDNA已經(jīng)逐漸應(yīng)用到臨床領(lǐng)域，但其許多生物學(xué)特性仍不清楚。例如，ctDNA片段的大小仍然是不確定的：有些人認(rèn)為它比cfDNA長(zhǎng)[ 9]。但另外一些人持相反態(tài)度[10]，Jiang等發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血漿中都存在極長(zhǎng)或極短的核酸分子，短的片段易檢測(cè)出腫瘤相關(guān)拷貝數(shù)畸變[11]；Madhavan等報(bào)道了乳腺癌患者也存在類似的現(xiàn)象[12]。

ctDNA的來源目前研究報(bào)道有三種：①細(xì)胞凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞；②活的腫瘤細(xì)胞；③循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)。有研究表明，cfDNA片段大小約166 bp，類似于那些典型的凋亡細(xì)胞釋放的cfDNA的長(zhǎng)度[13]。在凋亡細(xì)胞中的蛋白水解活性異?？梢詫?dǎo)致 DNA和核小體釋放進(jìn)入血液循環(huán)。Roth等發(fā)現(xiàn)，在凋亡細(xì)胞中相關(guān)的蛋白水解活性伴隨血液中脫氧核糖核酸水平的升高而發(fā)生相應(yīng)變化[14]。在腫瘤進(jìn)展過程中，凋亡的腫瘤細(xì)胞的蛋白水解酶活性變化使DNA和核小體進(jìn)入血液[15]。以上這些研究都支持ctDNA可能來自凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞。然而，早期癌癥患者血漿中也含有ctDNA，因此凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞可能不是它唯一的來源。體外研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以連續(xù)自動(dòng)地釋放脫氧核糖核酸，早期乳腺癌患者可檢測(cè)到ctDNA，并且ctDNA的數(shù)量增加與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)，進(jìn)一步支持ctDNA可能來源于活體腫瘤細(xì)胞。有研究證明ctDNA和CTC包含相同的基因突變，而血液既包含CTC又包含ctDNA，這說明CTC可能是ctDNA另一個(gè)來源。

ctDNA對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移起到重要的作用。1999年Garciía-Olmo等表明從荷瘤鼠得到的血漿可以穩(wěn)定地改變體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞，并首次提出了假設(shè)：“genometastasis”，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)占主導(dǎo)地位的癌基因來自原發(fā)腫瘤，推測(cè)其由于易感細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，到達(dá)遠(yuǎn)處的目標(biāo)器官，并在血漿中循環(huán)[16]。ctDNA在腫瘤的轉(zhuǎn)移中通過攝取凋亡小體或virtosomes在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間水平移動(dòng)，導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明ctDNA與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。已有研究報(bào)道，ctDNA與腫瘤的脈管侵襲有相關(guān)性，當(dāng)腫瘤患者血管侵襲時(shí)血漿中ctDNA具有顯著更高的檢出率[17]。

2 技術(shù)與應(yīng)用

2.1 ctDNA的分離提取技術(shù) ctDNA在血液中的含量極少，片段很小，提取難度大。目前提取cfDNA最常用的方法主要有傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法，磁珠法(SIGMA)、硅膠膜吸附柱法(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen)等。但每種方法都存在它的優(yōu)缺點(diǎn)。

傳統(tǒng)的cfDNA的提取方法是酚-氯仿-異戊醇法，后來在傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在DNA沉淀步驟中配合使用DNA助沉劑，以期使得經(jīng)過酚-氯仿去除蛋白等污染的DNA分子盡可能多的析出并沉淀。酚-氯仿-異戊醇配合微量DNA助沉劑法比傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法可以獲得更高的DNA含量及純度，但是兩種方法的DNA純度未達(dá)到1.8～2.0這一理想?yún)^(qū)間，提示所提取DNA中可能含有蛋白或多糖污染。

磁珠法的主要材料是一種表面包裹有介孔二氧化硅的磁性復(fù)合微?！榭准{米磁珠，其特點(diǎn)為具有較大的表面積和較強(qiáng)磁分離能力，且制備工藝過程簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，尤其適合于痕量DNA樣品的提取。但這種方法純度相對(duì)較低，這可能是由于磁珠的吸附能力的限制。介孔納米磁珠理論吸附能力為每1 μl磁珠可吸附10 ng DNA分子，適用于DNA含量極少的樣品。

QIAamp試劑盒是目前較公認(rèn)的cfDNA提取試劑盒。各實(shí)驗(yàn)室的提取濃度略有不同。然而所提取cfDNA的純度值則鮮有報(bào)道。楊波應(yīng)用QIAamp試劑盒提取90例cfDNA測(cè)得OD260/OD280介于1.24～1.76，亦未達(dá)到1.8～2.0這一理想?yún)^(qū)間，由此推斷，由于cfDNA提取難度較大，即使使用國際公認(rèn)的試劑盒，同樣會(huì)存在一定的蛋白或多糖污染，影響其純度值。但qPCR結(jié)果表明，雖然所提取的DNA純度未達(dá)到1.8～2.0這一理想?yún)^(qū)間，但是仍可有效進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率為100%。

2.2 ctDNA的檢測(cè)技術(shù) 由于ctDNA的量少且片段小，對(duì)它的檢測(cè)造成了很大的阻礙。ctDNA檢測(cè)技術(shù)可分為兩個(gè)階段。第一階段為基于PCR技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)，如直接測(cè)序法(Sanger法)、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)法、微滴數(shù)字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)、BEAMing數(shù)字PCR法、COBAS法等。第二階段為在NGS基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)方法。

直接測(cè)序法：Sanger法是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X射線膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

ARMS法是利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性 PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測(cè)出突變。ARMS方法檢測(cè)靈敏度明顯高于直接測(cè)序法等其他方法，可檢測(cè)出樣品中含量低至0.1%～1.0%的突變基因；該方法結(jié)合實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增時(shí)閉管操作，操作簡(jiǎn)單，無需產(chǎn)物的后處理，能最大程度地避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染?，F(xiàn)已成為國際上腫瘤個(gè)體化分子檢測(cè)最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)已被業(yè)內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。

數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作為DNA定量的新技術(shù)，是將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)ctDNA進(jìn)行絕對(duì)定量，靈敏度可達(dá)到單個(gè)核酸分子，檢測(cè)限低至0.001%，但同時(shí)也存在只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)、通量低的缺點(diǎn)。

BEAMing技術(shù)是結(jié)合數(shù)字PCR與流式技術(shù)，利用特異性PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)突變區(qū)，與磁珠(磁珠上固定有特異的PCR引物)混合進(jìn)行油包水單分子擴(kuò)增反應(yīng)。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結(jié)合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出紅色或綠色熒光，使用流式細(xì)胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。這種方法實(shí)現(xiàn)了單分子DNA絕對(duì)定量，其劣勢(shì)是成本高、操作復(fù)雜，而且成功率不算太高，因此目前應(yīng)用并不廣泛。

現(xiàn)在對(duì)ctDNA的檢測(cè)方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，大家都在探索中。Thress等通過檢測(cè)38例肺癌患者的EGFR敏感突變以及T790M耐藥突變，對(duì)比分析了4種檢測(cè)方法(ARMS法、COBAS法、微滴數(shù)字PCR法以及BEAMing 數(shù)字PCR 法)在組織和血漿ctDNA中的敏感性和特異性。對(duì)于EGFR敏感突變，COBAS法、微滴數(shù)字PCR法以及BEAMing數(shù)字PCR 法敏感性略高(86%～100%)，但三者之間差異不明顯；然而，對(duì)于T790M 突變，微滴數(shù)字PCR法和BEAMing數(shù)字PCR法具有更高的敏感性(69%～71%)，明顯高于ARMS法(29%)和COBAS 法(41%)；以上結(jié)果提示數(shù)字化PCR平臺(tái)具有更好的敏感性。但是，伴隨檢測(cè)敏感性的提高，特異性卻下降，微滴數(shù)字PCR法和BEAMing法檢測(cè)EGFR敏感突變的特異性僅為83%和67%，明顯低于ARMS 法和COBAS 法(二者均為100%)，因此尋找二者之間的平衡點(diǎn)顯得尤為重要。雖然這些基于PCR的方法具有較好的臨床可應(yīng)用性，但主要針對(duì)單個(gè)或幾個(gè)基因已知的突變檢測(cè)。

隨著研究的深入，僅檢測(cè)幾個(gè)基因變異是不夠的，需要建立多基因檢測(cè)平臺(tái)，NGS為此提供了機(jī)會(huì)。NGS 技術(shù)的檢測(cè)限為0.2%～1%，可以在保證敏感性的基礎(chǔ)上檢測(cè)盡可能多的基因變異。在NGS的基礎(chǔ)上發(fā)展了很多新技術(shù)，其中尤為典型的是Newman等開發(fā)的一種稱為癌癥個(gè)性化分析深度測(cè)序(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq)對(duì)ctDNA進(jìn)行量化。該方法利用定制化的NimbleGen SeqCap EZ Choice Library作為”篩選器”(包含了139個(gè)相關(guān)基因的521個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，共約125 kb)對(duì)樣本進(jìn)行靶向捕獲后再進(jìn)行深度測(cè)序，也就是用新一代測(cè)序儀預(yù)選特異性超過97%的預(yù)擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行有針對(duì)性的深度測(cè)序[15]。CAPP-seq對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的ctDNA檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)可行。用CAPP-seq發(fā)現(xiàn)在I期和II～I(xiàn)V期非小細(xì)胞肺癌患者中，ctDNA的檢出率分別為50%和100%。Couraud等[18]利用NGS技術(shù)同時(shí)分析了107個(gè)血漿標(biāo)本的多個(gè)基因(包括EGFR、ERBB2、K-Ras、BRAF 以及PIK3CA)，與組織標(biāo)本相比，檢測(cè)的敏感性為58%(43% ～71%)，特異性為87%(62%～96%)。近期Lebofsky等[19]利用NGS技術(shù)檢測(cè)了27例不同瘤種患者ctDNA 中的46 個(gè)基因，涵蓋6800個(gè)COSMIC熱點(diǎn)突變，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移灶組織活檢出的29 個(gè)突變有28 個(gè)可以在ctDNA 中檢測(cè)到。這些結(jié)果證明NGS 技術(shù)用于ctDNA 多基因突變檢測(cè)的可行性。

NGS 技術(shù)不僅可以用于檢測(cè)已知基因變異，更重要的是可以進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的基因變異分析，包括基因突變、重排以及基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)，并可以發(fā)現(xiàn)未知的基因變異。然而，這些新技術(shù)還是有它的的局限性。首先，NGS相關(guān)的檢測(cè)方法能檢出約50%的早期患者，因此敏感性要求進(jìn)一步提高。此外，成本保持相對(duì)較高，限制了其臨床應(yīng)用。幸運(yùn)的是，第三代測(cè)序技術(shù)，高通量，測(cè)序成本逐漸降低使ctDNA的檢測(cè)更有希望廣泛應(yīng)用于臨床領(lǐng)域[20、21]。

2.3 ctDNA的臨床應(yīng)用

2.3.1 通過腫瘤基因分型來實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療 基因分型可以分析遺傳突變，在癌癥治療過程中具有重要的作用[22，23]。傳統(tǒng)的組織活檢只能獲得局部和靜態(tài)的腫瘤信息，無法實(shí)時(shí)反映由于腫瘤異質(zhì)性和持續(xù)進(jìn)展中不同階段的基因分型[24]。Dawson等[25]在30例具有點(diǎn)突變或結(jié)構(gòu)變異的晚期乳腺癌患者的治療過程中動(dòng)態(tài)獲取ctDNA進(jìn)行了深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)同一腫瘤患者不同階段的ctDNA基因突變，根據(jù)不同的基因分型針對(duì)性地進(jìn)行靶向治療和藥物療效監(jiān)控，可以起到更好的治療效果[26]。因此，基于ctDNA分析的液體活檢可以提高對(duì)腫瘤基因分型的分析和靶向治療水平，對(duì)患者制定個(gè)性化醫(yī)療方案有重要作用，并在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的推動(dòng)上發(fā)揮重要的作用。

2.3.2 疾病監(jiān)測(cè)與治療評(píng)價(jià) 多數(shù)惡性腫瘤在治療過程中進(jìn)展快且易復(fù)發(fā)。疾病監(jiān)測(cè)與治療評(píng)價(jià)對(duì)臨床醫(yī)生確定后續(xù)治療方案是很重要的。Bettegowda等已經(jīng)表明，連續(xù)ctDNA 檢測(cè)可用于評(píng)價(jià)治療效果、評(píng)估緩解狀態(tài)和檢測(cè)復(fù)發(fā)與進(jìn)展[27]。ctDNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌癥患者的檢出率分別為47%，55%、69%及82%，這表明ctDNA水平增加與癌癥進(jìn)展相關(guān)。此外，Diehl等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者在手術(shù)后ctDNA水平有明顯的減少或缺如。在本研究中術(shù)后檢測(cè)到ctDNA的患者都復(fù)發(fā)，而那些沒有檢測(cè)到ctDNA的患者得到緩解[ 3]。Reinert等發(fā)現(xiàn)利用ctDNA檢測(cè)方法比利用常規(guī)檢測(cè)方法隨訪患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)早十個(gè)月[28]。這些研究表明ctDNA檢測(cè)可以快速預(yù)測(cè)治療結(jié)果，并為臨床醫(yī)生確定下一個(gè)治療方案提供重要參考。

2.3.3 循環(huán)腫瘤DNA與耐藥的機(jī)制 耐藥性是癌癥治療失敗的主要原因。然而到目前為止，對(duì)腫瘤耐藥研究的適當(dāng)方法還沒有建立[ 29]。ctDNA檢測(cè)的低創(chuàng)性和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的耐藥機(jī)制提供了一個(gè)可行的方法。Diaz等分析接受EGFR抑制劑治療的肺癌患者的ctDNA，發(fā)現(xiàn)了42個(gè)KRAS基因突變。進(jìn)一步的研究表明，這種方法可比常規(guī)方法早5個(gè)月檢測(cè)出與腫瘤進(jìn)展和耐藥相關(guān)的標(biāo)志[ 30，31 ]。肺癌患者接受一二代EGFR抑制劑治療發(fā)生耐藥后，我們可以通過血液中的ctDNA來檢測(cè)不同時(shí)期的耐藥突變，選擇靶向藥物。例如，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者，AZD9291在發(fā)生T790M耐藥突變時(shí)有很好的抗腫瘤抗性；crizotinib在發(fā)生METexon14剪接點(diǎn)突變時(shí)有較好的效果。因此，通過ctDNA的液體活檢實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥突變選擇靶向藥物可以更好地指導(dǎo)個(gè)性化用藥，減少副作用，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

2.3.4 ctDNA檢測(cè)開啟腫瘤預(yù)防新時(shí)代 目前，基于ctDNA的液體活檢是腫瘤早篩和復(fù)發(fā)檢測(cè)的新手段，可以根據(jù)ctDNA的檢測(cè)結(jié)果為腫瘤的預(yù)防提供指導(dǎo)。這是因?yàn)榘┌Y漫長(zhǎng)的發(fā)病過程為預(yù)防提供了充足的時(shí)間，加上分子癌變的發(fā)生是在癌癥啟動(dòng)最早階段，而不是組織學(xué)的結(jié)果，所以可以把癌癥的預(yù)防線從原來癌癥早期階段推前到細(xì)胞癌變的階段，這是傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)檢測(cè)都難以達(dá)到的。Diehl等通過研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后和癌癥早期檢測(cè)出ctDNA的人是癌癥的高危人群，我們可以根據(jù)檢查結(jié)果對(duì)患者采取預(yù)防措施[3，32]。因此，分子技術(shù)的發(fā)展特別是腫瘤分子技術(shù)的發(fā)展，開啟了腫瘤預(yù)防的新時(shí)代。

2.4 ctDNA的挑戰(zhàn) ①檢測(cè)方法不統(tǒng)一，缺少標(biāo)準(zhǔn)化流程。從基于PCR的技術(shù)到NGS 技術(shù)，除了ARMS 法，其他檢測(cè)方法并未形成標(biāo)準(zhǔn)化的流程。另外，各中心在樣本處理以及病例選擇、數(shù)據(jù)分析方面的差異導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性欠佳。因此，我們需要進(jìn)一步標(biāo)化檢測(cè)方法，盡可能減少人為因素帶來的偏倚。②雖然ctDNA 基因檢測(cè)的特異性較好，但敏感性卻不理想，如果提高敏感性，又可能導(dǎo)致特異性的下降。因此，選擇合適的檢測(cè)方法找到敏感性和特異性之間的平衡點(diǎn)是解決的辦法。③利用ctDNA進(jìn)行NGS的全基因組測(cè)序可以進(jìn)行多基因甚至基因組分析，還可以發(fā)現(xiàn)未知的基因變異。但這要求更大量的ctDNA輸入量，但勢(shì)必同時(shí)帶來更多正常cfDNA的干擾。因此，需要進(jìn)一步研究如何提高ctDNA純度。④由于腫瘤異質(zhì)性的存在，局部組織穿刺標(biāo)本很難用于基因變異的定量分析，但外周血中的ct-DNA可能反映腫瘤DNA整體水平，因此可以用于基因變異的定量分析。目前用于定量分析的方法很多，但同樣是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的流程、缺乏統(tǒng)一的與臨床相關(guān)的定量數(shù)據(jù)，缺乏各定量方法間優(yōu)缺點(diǎn)的比較，因此，基于ct-DNA的定量研究尚處于起步階段。

總而言之，ctDNA的檢測(cè)無論展現(xiàn)患者對(duì)手術(shù)的應(yīng)答情況、早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、實(shí)時(shí)追蹤腫瘤進(jìn)展，還是在腫瘤耐藥突變檢測(cè)，為其尋找有效的癌癥療法或者藥物組合等方面都體現(xiàn)了ctDNA的在臨床應(yīng)用的巨大前景?！禔SCO年度報(bào)告：2015臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展》中，液體活檢技術(shù)被列為腫瘤治療領(lǐng)域下一個(gè)十年趨勢(shì)之一。ctDNA作為液體活檢的首選已逐漸從科研走向臨床。而歐盟批準(zhǔn)將ctDNA檢測(cè)用于吉非替尼的伴隨診斷則更是標(biāo)志著ctDNA臨床應(yīng)用的大規(guī)模實(shí)現(xiàn)[33]，在此觀點(diǎn)上包括美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)、歐洲臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ESMO)及中國肺癌EGFR基因突變檢測(cè)專家共識(shí)等指南均達(dá)到一致意見。但在ctDNA的檢測(cè)到臨床應(yīng)用仍是一條布滿荊棘卻充滿希望的路，需要我們不懈努力。

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Detection and related advancs in the study of Circulating Tumor DNA

ZHANG Xiao-huan12，ZHOU Yu2

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81400437)

R73-3

B

1672-6170(2017)01-0148-05

2016-01-09；

2016-06-24)