張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

基礎(chǔ)醫(yī)學

不同濃度TGF-β1對人髓核細胞外基質(zhì)成分基因表達的調(diào)控作用比較＊

張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

目的研究在體外培養(yǎng)條件下，不同濃度轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）對人髓核細胞聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原及SOX-9基因表達的調(diào)控作用。方法以傳2代人髓核細胞為研究對象，分別以0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1為培養(yǎng)液，設(shè)不含生長因子培養(yǎng)液為對照組，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9 mRNA表達情況。結(jié)果0.1μg/L TGF-β1組與對照組相比，無顯著性差異。1μg/L、10μg/L和100μg/L TGF-β1組在促進Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達方面作用顯著，差異均具統(tǒng)計學意義。其中，10μg/L組促進細胞mRNA表達作用最明顯。結(jié)論TGF-β1能夠促進髓核細胞Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因的表達，提示TGF-β1有可能在椎間盤退行性疾患的預防和治療中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1；髓核細胞；基因表達；聚集蛋白聚糖；Ⅱ型膠原；SOX-9基因

椎間盤退變引起的頸肩痛、腰腿痛十分常見，當前的治療方法雖然能夠解除疼痛，但不能修復退變的椎間盤。只有通過細胞學的方法維持細胞外的正常基質(zhì)成分，從而重建椎間盤的高度和生物學性能，才能從根本上阻止或延緩椎間盤退變；髓核細胞作為分泌髓核內(nèi)基質(zhì)的主要載體，其在正常髓核組織內(nèi)數(shù)目較少，在體外培養(yǎng)條件下容易發(fā)生去分化，喪失正常的細胞表型，這就限制了髓核細胞生物學治療的應(yīng)用［1］。通過生長因子的方法，刺激髓核細胞合成細胞外基質(zhì)，為逆轉(zhuǎn)椎間盤退變帶來了新思維［2］。本實驗通過研究不同濃度TGF-β1對人正常髓核細胞Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因表達的調(diào)控作用，來探索早期阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和髓核組織來源HAM’S/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone公司，美國），Ⅱ型膠原酶（Gibco公司，美國），MTT、DMSO（Sigma公司，美國），培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Corning公司，美國），rh-TGF（Peprotech公司，美國），引物由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成，Trizol reagent試劑（Gibco公司，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）。人髓核組織取自青少年脊柱側(cè)彎矯形手術(shù)患者。

1.2 細胞分離與培養(yǎng)取得髓核組織后，立即在超凈工作臺內(nèi)篩選實驗用的髓核組織，去除纖維環(huán)及交界區(qū)組織，用PBS沖洗后剪成碎組織塊，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min搖動一次，800～1000 rpm離心5min，去上清液，用0.2%的膠原酶于37℃下消化4 h，120目尼龍網(wǎng)篩過濾，細胞懸液1000 rpm離心5min，棄去上清液，D-Hanks液懸浮細胞，1000 rpm，離心5min，進行酶液清洗，共三次。清洗后的細胞，用F12-10%FBS（胎牛血清）2m l稀釋，臺盼蘭染色，計數(shù)板進行細胞計數(shù)。以2×104細胞/cm2接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔2～3 d換液、細胞生長達80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 總RNA提取和RT-PCR取處于對數(shù)生長期的傳2代人髓核細胞，達80%融合后，1000 rpm離心后，去上清，用含10%FBS的F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×104/m l，按1∶5接種于5個75 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后，吸出培養(yǎng)基，分別加入由10%FBS/ F12配制成的0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1，對照組不加生長因子。培養(yǎng)瓶內(nèi)的各組細胞培養(yǎng)72 h，按照Gibco公司Trizol一步法說明，提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測純度與濃度。取2μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA通過Real-Time PCR對蛋白多糖、Ⅱ型膠原、SOX-9進行擴增。以管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)文獻報道合成［3］：GAPDH上游：5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，下游5'-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3'；PCR的反應(yīng)條件均為：94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳圖片用IBAS2.5圖像處理系統(tǒng)分析，以Aggrecan和Ⅱ型膠原吸光度與GAPDH吸光度的比值作為其相對表達量。

以上實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析用SPSS 15.0軟件中的One-Way ANOVA法，對實驗測得的吸光度值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，檢測結(jié)果以x±s表示，比較試驗組和對照組間的吸光度值差異，結(jié)果進行t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

10%血清條件下，在Aggrecan表達方面，對照組的吸光度比值為0.775±0.024，TGF-β1 0.1μg/L組的吸光度比值為0.828±0.008，與對照組相比，無顯著性差異，1μg/L、10μg/L、100μg/L組的吸光度比值分別為1.361±0.016、1.814±0.029、1.163±0.027，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。在促進Ⅱ型膠原基因表達方面，與對照組的吸光度比值1.312± 0.036相比，TGF-β1 0.1μg/L組無顯著性差異（P> 0.05），1μg/L、10μg/L、100μg/L組差異均具統(tǒng)計學意義，其中，10μg/L組促進細胞表型基因mRNA表達作用最明顯。在促進SOX-9基因表達方面，與對照組相比，0.1μg/L組無顯著性差異（P>0.05），1μg/ L差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）、10μg/L、100μg/L組差異非常顯著（P<0.01）。

3 討論

椎間盤退變是一種發(fā)病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸腰腿痛，其中髓核組織在椎間盤退變過程中起首要的作用［4］。正常髓核組織呈膠凍狀，主要是軟骨特異性基質(zhì)成分蛋白聚糖和Ⅱ型膠原組成，與軟骨組織相比，髓核組織中蛋白多糖的含量相對較高，比較髓核內(nèi)和軟骨內(nèi)蛋白多糖與Ⅱ型膠原的比例，髓核組織約為27∶1，而軟骨組織只有2∶1［5］。蛋白多糖被包埋在由Ⅱ型膠原組成的網(wǎng)格中，其中Aggrecan是蛋白多糖的主要成分，吸附水分的能力特別強大，因此，正常髓核組織含水量非常豐富，可達80%，具有屈曲性和黏彈特性，能夠承受壓力、吸收震蕩［6］。髓核組織為無血管組織，營養(yǎng)的供給主要通過組織間的彌散和滲透，長期承受壓應(yīng)力、剪切力，極易發(fā)生退變。退變后Aggrecan和Ⅱ型膠原逐漸減少，Ⅰ型膠原增多，促使髓核結(jié)構(gòu)逐漸纖維化，喪失承受壓力的能力，并導致纖維環(huán)、軟骨終板的退變。

目前治療椎間盤退變性疾病的方法包括保守治療和手術(shù)治療，這些措施雖能緩解癥狀，并不能解決椎間盤本身的退變問題，其遠期療效并不理想［7］。隨著組織工程及再生醫(yī)學的發(fā)展，以細胞為基礎(chǔ)的生物學治療修復退變的椎間盤逐漸成為國內(nèi)外學者的方向［8，9］，而利用細胞因子的作用，提高髓核細胞的活性，促進正常細胞外基質(zhì)的合成，為延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進程提供了可能。TGF-β1是一種分子量為25 kd的雙鏈多肽，具有促進細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞分化，促進細胞外基質(zhì)合成功能［10］。本課題組之前的研究提示，在10%血清條件下，TGF-β1能提高細胞的增殖活性，并且在1~10μg/L的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系［11］。

由于髓核細胞缺乏特異性細胞標志，國內(nèi)外研究中通常選用蛋白多糖、Ⅱ型膠原和SOX-9作為髓核細胞的特異性標記。SOX-9基因是促進軟骨細胞分化和維持軟骨細胞表型的調(diào)控基因，與椎間盤退變密切相關(guān)，它能增加椎間盤基質(zhì)中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，延緩椎間盤退變的發(fā)展［12］。本研究結(jié)果提示，TGF-β1在1～100μg/L濃度時對可以顯著促進Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因的表達，說明在體外培養(yǎng)條件下，TGF-β1對人髓核細胞的表型表達具有重要的促進和維持作用，特別是在濃度10μg/L時調(diào)控作用最顯著。這就使體外培養(yǎng)髓核細胞作為組織工程椎間盤的種子細胞成為可能。

［1］吳劍宏，阮狄克，王德利，等.重組腺相關(guān)病毒介導人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)染對人髓核細胞功能的影響［J］.中國脊柱脊髓雜志，2012，22（9）：843-849.

［2］Daisuke S，Tomoko N，Joji M，et al.Differential phenotype of intervertebral disc cells［J］.Spine，2009，34（12）：1448-1456.

［3］Zhen L，Keren MK，Abraham W，et al.Biomimetic fibrin-hyaluronan hydrogels for nucleus pulposus regeneration［J］.Regen Med，2014，9（3）：309-326.

［4］Krzysztof S，Howard A，Koichi M，et al.The effect of age，sex，ethnicity，and spinal level on the rate of intervertebral disc Degeneration［J］.Spine，2011，36（12）：1333-1330.

［5］張燕，阮狄克，張超，等.接觸式細胞共培養(yǎng)誘導人臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞向類髓核細胞分化［J］.中國脊柱脊髓雜志，2012，22（10）：936-942.

［6］Barrett I，Woods，Nam VO，et al.Gene therapy for intervertebral disk degeneration［J］.Orthop Clin N Am，2011，42（5）：563-574.

［7］Wan Y，F(xiàn)eng G，Shen FH，et al.Biphasic scaffold for annulus fibrosus tissue regeneration［J］.Biomaterials，2008，29（6）：643-652.

［8］Chan LK，Leung VY，Tam V，et al.Decellularized bovine intervertebral disc as a natural scaffold for xenogenic cell studies［J］. Acta Biomater，2013（9）：5262-5272.

［9］Xu B，Xu H，Wu Y，et al.Intervertebral disc tissue engineering with natural extracellular matrix-derived biphasic composite scaffolds［J］.PLoS ONE，2015，10（4）：e0124774.

［10］Hsieh HL，Wang HH，Wu WB，et al.Transforming grow th factor-b1 inducesmatrixmetalloproteinase-9 and cell migration in astrocytes：roles of ROS-dependent ERK-and JNKNF-B pathways［J］.Journal of Neuroinflammation，2010，7（1）：88.

［11］張榮峰，阮狄克，張超，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1和胰島素樣生長因子-1對人髓核細胞體外增殖活性的影響［J］.中國脊柱脊髓雜志，2006，16（11）：856-860.

［12］Gruber HE，Norton HJ，Ingram JA，et al.The SOX-9 transcription factor in the human disc：decreased immunolocalization with age and disc degeneration［J］.Spine，2005，30（6）：625-630.

［2016－07－13收稿，2016－08－11修回］［本文編輯：宋敏］

Com parative study on the regulation effects of TGF-β1 at d ifferent concentration in vitro on cellular aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of hum an nucleus pulposus

ZHANG Rong-feng①，SUN Xin-jun，ZHANG Chao，et al.①Department of Orthopedics，the 89th Hospital of People's Liberation Army，Weifang，Shandong 261000，China

Objective To investigate the regulation effects of TGF-β1 on aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus at different concentration in vitro.Methods Passage 2 nucleus pulposus cells were cultured in the medium with 10%FBS and at different concentrations（TGF-β1 as 0.1μg/L，1.0μg/L，10μg/L，100μg/L）.The medium without TGF-β1 was taken as control group.The mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene was assayed by RT-PCR.Results The 0.1μg/L TGF-β1 group hadn't significant difference compared with the control group.The 1μg/L，10μg/L and 100μg/L groups，promoted mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene compared with the control group，the difference had statistical significance.Conclusion TGF-β1 is efficient to promote aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus which might be a future therapeutic potential in the treatment of intervertebral disc degeneration.

Transforming growth factor-β1；Nucleus pulposus cells；Gene expression；Aggrecan；CollagenⅡ；SOX-9 gene

R681.5+3

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.017

國家自然科學基金項目（30370389）

261000山東濰坊，解放軍89醫(yī)院骨科（張榮峰，孫新君）；100037北京，海軍總醫(yī)院骨科（張超，阮狄克）