杜晨霄 張學美

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，云南 昆明 650000)

JAK2基因陰性骨髓增殖性腫瘤與CALR基因突變的相關(guān)性診斷研究進展

杜晨霄 張學美

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，云南 昆明 650000)

骨髓增殖性腫瘤；JAK2基因；CALR基因；突變

長久以來，國內(nèi)外大量研究都證實了Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)基因突變在骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative diseases, MPD)中的高發(fā)陽性率，2016年世界衛(wèi)生組織診斷標準也重申了JAK2基因作為診斷MPD的重要性。雖然JAK2基因的體細胞突變發(fā)生在許多MPD中，但是仍存在大量JAK2陰性的骨髓增殖性腫瘤，且其分子發(fā)病機制仍不明確。因此這類腫瘤的診斷標準亟待進一步研究。近年來，國外研究表明：采用全基因組測序(whole ge-nome shot-gun，WGS)技術(shù)在JAK2陰性的一組MPN患者中，發(fā)現(xiàn)一新的高頻基因突變：鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CALR)基因突變[1-2]。

1 CALR蛋白結(jié)構(gòu)及功能

CALR是一種多功能蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中充當主要的Ca2+結(jié)合蛋白。該蛋白大量存在于非肌肉組織中，結(jié)合鈣離子能力極強。其分子生物學結(jié)構(gòu)和功能區(qū)為N-末端區(qū)、P區(qū)和C-末端區(qū)。N末端區(qū)包含(1～180)氨基酸殘基，其中氨基酸序列結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，有球形β-折疊結(jié)構(gòu)；P區(qū)包含(181～280)氨基酸殘基，含脯氨酸，由兩條發(fā)卡結(jié)構(gòu)的β-折疊；C-末端呈強酸性，能結(jié)合大量鈣離子，但親和力低，且C-末端富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(ER retention signal，KDEL)四肽序列。最近有研究表明，CALR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，可確保新合成的糖蛋白能正確折疊，并參與調(diào)節(jié)鈣的穩(wěn)定狀態(tài)[3]；而在細胞外液中，CALR參與、調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡及吞噬和免疫抗原提呈應答[4-5]。研究者利用WGS技術(shù)在大量的JAK2陰性MPN成年患者中檢測出了CALR異常[1]，稱為CALR基因突變[7]。

2 CALR突變對MPN患者有核紅細胞的影響

CALR是一種Ca2+結(jié)合蛋白，其在能與其N/P結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì)細胞區(qū)室之間穿梭。根據(jù)研究表明，多數(shù)CALR基因突變與JAK2V617F基因突變不共存，因此CALR基因陽性表達的細胞內(nèi)JAK2基因為陰性[10-14]。根據(jù)人類促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)參與誘導下的鈣離子通道激活的途徑，有研究者[13]明確了CALR蛋白參與紅細胞生成的原理，他們通過Western印跡法，發(fā)現(xiàn)MPN患者組與正常對照組在體外生成紅細胞(骨髓有核紅細胞)時分別在細胞液中表達了不同的CALR濃度。Ca2+只在正常成紅細胞內(nèi)調(diào)解CALR的結(jié)構(gòu)。正常成紅細胞主要在細胞表面的C末端結(jié)構(gòu)域(C-CALR)和細胞基質(zhì)中的N末端結(jié)構(gòu)域(N-CALR)表達，且其表達隨著兩個表位的結(jié)構(gòu)成熟度降低。由此可知，在JAK2基因陰性的CALR基因陽性MPN患者中，由于CALR基因突變，導致高水平的Ca2+表達[6]。在正常成紅細胞胞質(zhì)中，C-CALR的應激反應表達與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptors，GR)有關(guān)。在這些細胞中，Ca2+通道的減少和細胞核抑制增加了GR核素定位，同時在GR激動劑地塞米松作用下減少胞質(zhì)中C-CALR- N-CALR/GR連接及增殖的檢測率。C-CALR/GR和地塞米松反應被Ca2+和EPO的增加而替代。通過對比，患者組的原始紅細胞細胞膜表達的N-CALR為正常水平，但細胞核的C-CALR表達幾乎檢測不到。這些細胞的GR主要存在細胞核內(nèi)，并對地塞米松受體激動劑無應答。藥物Ruxolitinib可拆解C-CALR, C-CALR/GR連接并對抗MPN患者細胞中的地塞米松反應，且此藥物的作用為拮抗細胞核分裂及抑制鈣離子。這些結(jié)果表明Ca2+誘導的鈣網(wǎng)蛋白的構(gòu)象變化調(diào)節(jié)正常成紅細胞中GR的細胞核分裂，而JAK2V617F基因陽性讓MPN患者的Ca2+失去這項功能，反之在CALR基因陽性MPN患者中Ca2+高度活躍[13]。

3 JAK2基因陰性的CALR基因突變與MPN患者臨床表現(xiàn)及預后的相關(guān)性研究

2013年，有研究[10]發(fā)現(xiàn)CALR基因中的復發(fā)突變，與JAK2基因突變相互排斥。該小組以一組MPN患者為對象(184例患者)研究CALR突變的發(fā)病率和分子特征。數(shù)據(jù)分析顯示JAK2突變和CALR突變組之間存在顯著差異，ET患者中，JAK2陽性的患者血紅蛋白水平和白細胞計數(shù)明顯高于JAK2陰性的CALR陽性患者；但其血小板計數(shù)明顯高于前者。JAK2陰性的CALR基因陽性ET患者初診年齡也較年輕。在骨髓纖維化期MPF患者中，CALR+患者的貧血程度較JAK2+患者更輕。Rotunno等[17]研究發(fā)現(xiàn)CALR陽性和JAK2陽性ET 患者10年累積血栓形成風險各自為5.1% 和14.5%，15年累積血栓形成風險各自為10.5% 和25.1% 。2016年，有研究者[6]根據(jù)最近WHO診斷標準對120例BCR-ABL0的MPN患者進行骨髓CALR和JAK2基因突變測序，并分析CALR基因突變患者的臨床及實驗室特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：120例中樣品中，42例PV患者中38例JAK2陰性患者中未檢出CALR基因突變，39例ET患者中CALR陽性率在JAK2陰性ET患者中檢出率為12/22；39例PMF患者中，CALR陽性率在JAK2陰性PMF中檢出率為12/21。120 例患者中均未檢測到MPLW515 突變，結(jié)果中JAK2V617F、JAK2 Exon12、CALR、MPLW515 四種基因突變不共存[6,15]。英國研究室用WGS測序法測定3412例樣本CALR基因表達及突變，在對151例MPN患者樣本進行外顯子測序后發(fā)現(xiàn)，在無JAK2或MPL突變的MPN患者中，大多數(shù)存在CALR的體細胞突變。而CALR和JAK2、MPL突變不共存，97%的患者只存在這3種突變中的一種[19]。在表型水平，JAK2陰性CALR突變的ET患者中大部分患者的PLT計數(shù)大于1000×109/L。盡管如此，CALR突變ET患者的血栓形成風險顯著低于JAK2陽性ET患者，甚至在調(diào)整年齡后亦是如此。這些觀察結(jié)果與最近對891名WHO定義的ET患者的研究結(jié)果非常一致[15]。這些研究清楚的表明JAK2(V617F)是血栓形成的強烈獨立危險因素，而PLT計數(shù)大于1000×109/ L則與較低的血栓風險相關(guān)。JAK2(V617F)基因檢測陰性和顯著升高的PLT計數(shù)是CALR突變ET的主要特征。這些數(shù)據(jù)闡明了PLT計數(shù)本身在ET患者的血管并發(fā)癥的發(fā)病機制中的作用。他們強調(diào)了粒細胞/ PLT活化[16]和增加的WBC計數(shù)[14]與PLT計數(shù)本身更可能與血栓形成并發(fā)癥的發(fā)病機理相關(guān)的觀點。CALR基因突變對于患者脾腫大的發(fā)病率沒有統(tǒng)計學相關(guān)性；而血紅蛋白，血小板和WBC計數(shù)不影響血栓形成的風險[11-12]。

4 結(jié)果及總結(jié)

檢測CALR突變有助于對JAK2基因陰性的ET患者進行相應的分子診斷。 由于CALR陽性患者的血栓形成減少，可以說相對于JAK2 V617F基因突變的患者，前者具有更少的血栓形成指征和更好的預后。 因此，檢測CALR突變可能有助于ET患者的診斷和預后[11]。在ET 患者中CALR 突變陽性患者白細胞計數(shù)、危險度分層、血事件發(fā)生率低于JAK2 V617F 突變陽性患者；PMF 患者中CALR 突變陽性患者血紅蛋白濃度低于JAK2 V617F 突變陽性患者。結(jié)論為JAK2基因陰性MPN 患者中CALR 突變陽性患者與JAK2 V617F 突變陽性患者相比，發(fā)生血管事件風險更低、危險度分層更低且發(fā)病年齡小，因此預后較好。

不同類型的基因突變在PV、ET和PMF患者中的發(fā)生率差異較明顯，總體來看JAK2基因突變發(fā)生率較髙，且在PV患者中該突變的發(fā)生率高于ET和PMF患者。MPL基因突變陽性率較低，主要發(fā)生在ET和PMF患者中；CALR基因突變主要見于JAK2突變陰性的ET和PMF患者。JAK2基因突變與MPN患者臨床表現(xiàn)具有相關(guān)性，突變陽性的PV患者有著更高的外周血WBC、PLT計數(shù)水平；突變陽性的ET患者白細胞計數(shù)高于陰性，突變陰性患者外周血PLT計數(shù)較髙，其血栓發(fā)生率要高于CALR陽性的JAK2陰性MPN患者。

目前已知的與JAK2陰性MPN腫瘤發(fā)病有關(guān)的基因突變有多種，臨床試驗中也不斷檢測出更多導致腫瘤發(fā)生的基因突變，而CALR基因點突變的發(fā)現(xiàn)，讓PV、ET、PMF的發(fā)病機理的研究在分子層面有了很大的突破，對病人的明確診斷和治療也有很大的幫助。綜上所述，研究CALR基因?qū)MF患者臨床表現(xiàn)與預后關(guān)系可以提高腫瘤確診率，并對相關(guān)臨床癥狀進行合理治療有所貢獻，亦對患者預后評估有著很大幫助。

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山東省自然科學基金項目(2013GCC08)。

杜晨霄(1990—)，女，山東泰安人，昆明醫(yī)科大學碩士研究生在讀，主要從事血液病和血液腫瘤研究和臨床工作。

張學美，E-mail: zxm8955@ sohu.com。

R733.3

A

1004-7115(2017)07-0838-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.048

2017-04-02)