麥明琴 熊盈 周偉寧 黃偉偉 秦丹卿 張琪

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心廣州 511442）

●診療經(jīng)驗(yàn)●

QF-PCR在5 358例地中海貧血產(chǎn)前診斷中對(duì)常見染色體病的診斷價(jià)值

麥明琴 熊盈 周偉寧 黃偉偉 秦丹卿 張琪

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心廣州 511442）

目的：研究熒光定量PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF-PCR）技術(shù)在地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）產(chǎn)前診斷病例中對(duì)常見非整倍體染色體的檢測(cè)作用，了解此方法的運(yùn)用對(duì)地中海貧血產(chǎn)前診斷，同時(shí)快速排除胎兒常見染色體病的診斷價(jià)值。方法：回顧分析2015年1月～2017年1月因夫婦雙方為同型地貧在我院醫(yī)學(xué)遺傳中心行介入性產(chǎn)前診斷（取樣標(biāo)本包括絨毛、羊水與臍血）檢測(cè)胎兒地貧基因，同時(shí)行QF-PCR快速診斷常見染色體數(shù)目異常的5 358例產(chǎn)前診斷結(jié)果?？偨Y(jié)常見非整倍體染色體病在這組人群的檢出率，QF-PCR異常而地貧基因正?；蜉p型的病例再次行胎兒染色體核型分析驗(yàn)證。結(jié)果：5 358例地貧產(chǎn)前診斷標(biāo)本中，所有樣本均同時(shí)行QF-PCR檢測(cè)，選用STR（Short Tandem Repeat，STR）位點(diǎn)排查胎兒常見染色體非整倍體異常（13、18、21、X與Y染色體），共檢測(cè)出染色體異常占0.47%（25/5 358），其中4例合并重型地貧，胎兒引產(chǎn)未行染色體核型分析，其余21例均行染色體核型分析確診結(jié)果一致。結(jié)論：QF-PCR技術(shù)定量分析STR多態(tài)性位點(diǎn)能準(zhǔn)確、快速診斷常見非整倍體染色體病，是產(chǎn)前診斷中不可缺少的重要檢驗(yàn)方法，在常規(guī)地貧產(chǎn)前診斷病例中運(yùn)用能避免漏診染色體異常胎兒。

地中海貧血；熒光定量PCR；產(chǎn)前診斷；染色體非整倍體

QF-PCR技術(shù)是在PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)基礎(chǔ)上，通過(guò)定性、定量分析STR的多態(tài)性，診斷常見染色體非整倍體。目前能診斷的目標(biāo)染色體為21、18、13、X和Y 5種，診斷準(zhǔn)確率為99.2% ～100.0%。該技術(shù)由Adinolfi等于1995年建立。隨著產(chǎn)前診斷需求的不斷上升，QF-PCR技術(shù)凸顯出來(lái)的快速、準(zhǔn)確、不需要細(xì)胞培養(yǎng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)在產(chǎn)前診斷中有很大的應(yīng)用價(jià)值[1～2]，對(duì)地貧產(chǎn)前診斷病例同時(shí)行QF-PCR檢測(cè)，可減少漏診常見染色體病。地中海貧血是世界范圍內(nèi)最常見的常染色體隱性遺傳病，主要發(fā)病機(jī)制是由于珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致血紅蛋白珠蛋白合成障礙或減少。地中海沿岸、東南亞、印度、中東及我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)[3]。一項(xiàng)針對(duì)廣東地區(qū)26 543例個(gè)體的地貧基線調(diào)查顯示地貧基因攜帶率是16.83%，其中α、β地貧的攜帶率分別是12.96%和4.51%，同型夫婦攜帶率1.87%[4]。我院產(chǎn)前診斷中心承擔(dān)了廣東省全省重要的地貧防控工作，每年有大量的地貧產(chǎn)前診斷病例，其中大多數(shù)來(lái)源于基層轉(zhuǎn)診?？焖?、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷是防止出現(xiàn)重型地貧患兒的重要措施。本文統(tǒng)計(jì)在我中心行地貧產(chǎn)前診斷的5358例診斷結(jié)果，其中胎兒重型及中間型地貧的檢出率是20.1%（1 079/5 358），聯(lián)合QF-PCR快速診斷常見染色體非整倍體，染色體異常的檢出率是0.47%（25/5 358）?，F(xiàn)具體分析如下

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象選取2015年1月～2017年1月在我院醫(yī)學(xué)遺傳中心因夫婦雙方為同型地中海貧血攜帶者而前來(lái)行介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)、診斷胎兒地貧基因類型的病例5 358例，所有取樣均同時(shí)行QF-PCR分析STR多態(tài)性排除常見染色體非整倍體。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)前診斷樣本取樣根據(jù)孕婦就診孕周，采用絨毛活檢術(shù)、羊膜腔羊水穿刺術(shù)、臍靜脈穿刺術(shù)三種介入性產(chǎn)前診斷方法。排除穿刺的禁忌癥后，孕11～14周適宜行絨毛活檢術(shù)，16周后采取羊膜腔穿刺術(shù)，晚孕亦可采用胎兒臍靜脈穿刺取樣術(shù)。所有受檢胎兒術(shù)前行超聲檢查，了解胎兒發(fā)育情況、羊水量、胎盤位置等信息，絨毛穿刺術(shù)前常規(guī)超聲胎兒頸項(xiàng)透明層厚度（Nuchal Translucency Thickness，NT）檢查排除嚴(yán)重發(fā)育異常。

1.2.2 送檢樣本量地貧基因與QF-PCR檢測(cè)所需標(biāo)本的含量，絨毛需取樣2mg，羊水取樣15m l，臍血標(biāo)本需0.5m l。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器與方法配備毛細(xì)管電泳儀、PCR擴(kuò)增儀，QF-PCR技術(shù)檢測(cè)STR位點(diǎn)診斷常見染色體非整倍體13、18、21、X和Y。采用跨越斷裂點(diǎn)多聚酶鏈反應(yīng)Gap-PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交RDB-PCR（Reverse Dot Blot，RDB）技術(shù)，分別檢測(cè)6種常見α基因缺失與點(diǎn)突變及17種常見β點(diǎn)突變。染色體細(xì)胞培養(yǎng)方法分別是：根據(jù)取樣標(biāo)本不同，分別采用羊水原位細(xì)胞培養(yǎng)、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)與臍血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 QF-PCR陽(yáng)性率5 358例地貧產(chǎn)前診斷樣本中均同時(shí)行QF-PCR檢測(cè)常見染色體數(shù)目，共檢測(cè)出25例陽(yáng)性病例，檢出率為0.47%。其中4例因診斷為重型地貧胎兒引產(chǎn)而未行染色體核型分析以外，其余21例均行染色體G顯帶核型分析，結(jié)果與QF-PCR檢測(cè)一致。

2.2 地貧基因結(jié)果5 358例胎兒地貧產(chǎn)前診斷病例中重型及中間型地貧的檢出率為20.1%（1 079/5 358），其中重型及中間型α地貧占77.5%（836/1 079），重型及中間型β地貧的檢出率占22.5%（243/1 079）。

2.3 染色體核型結(jié)果QF-PCR陽(yáng)性病例中21例行染色體G顯帶核型分析，兩者結(jié)果一致。其中21三體12例，18三體4例，13三體1例，性染色體異常4例，包括1例XXY，2例XYY，1例X。胎兒染色體核型異常的21例。孕婦均選擇引產(chǎn)放棄胎兒。

3 討論

21、18、13、X和Y染色體非整倍是常見的染色體疾病，是胎兒染色體異常中的主要類型，其中的染色體三體是活產(chǎn)兒里唯一可以出現(xiàn)的染色體異常類型[5]。傳統(tǒng)的染色體核型分析目前仍是診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)、人員技術(shù)要求高、標(biāo)本需細(xì)胞培養(yǎng)、相對(duì)費(fèi)用較高等局限[6]。因此，在我們地貧產(chǎn)前診斷病例中，對(duì)篩查無(wú)胎兒染色體異常高危征象的胎兒，不需行報(bào)告周期長(zhǎng)的染色體核型分析，采用QF-PCR即能達(dá)到排除常見染色體異常的快速診斷目的，其具有高通量檢測(cè)、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)，因報(bào)告周期短（2～3 d），甚至24 h就能發(fā)放報(bào)告，可實(shí)現(xiàn)早診斷的目的[7～8]。在我中心行地貧產(chǎn)前診斷的病例，對(duì)已排除不良孕產(chǎn)史、胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常、胎兒染色體異常超聲軟指標(biāo)、母體高齡狀態(tài)等高危因素后，診斷地貧的同時(shí)采取單獨(dú)QF-PCR檢測(cè)；若合并上述高危因素時(shí)，則同時(shí)行染色體核型分析及（或）染色體微陣列分析。Rahil等在400例有產(chǎn)前診斷指征病例行羊水QF-PCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)1.5%（6/400）21、18、13染色體三體綜合征，結(jié)果與染色體核型分析一致，其結(jié)論提示QF-PCR檢測(cè)目標(biāo)染色體準(zhǔn)確率達(dá)100%[5]。Baig的研究提示QF-PCR對(duì)21、18、13、X和Y染色體檢測(cè)的靈敏度與特異度均為100%[9]。在我中心所做的5 358例地貧產(chǎn)前診斷病例中均采用QF-PCR方法同時(shí)行常見染色體非整倍的檢測(cè)，針對(duì)上述目標(biāo)染色體，我們的染色體異常檢出率為0.47%，與染色體G顯帶核型分析結(jié)果一致。

廣東省為地中海貧血高發(fā)區(qū)，在某些地區(qū)，地貧基因攜帶率可高達(dá)16.83%[4]，婚前、孕前篩查及孕后產(chǎn)前診斷是地貧防控的重要措施，孕期產(chǎn)前診斷作為二級(jí)預(yù)防是防止出生缺陷的重要環(huán)節(jié)。對(duì)地貧產(chǎn)前診斷的胎兒若無(wú)染色體異常的高危因素，我們建議采用QF-PCR技術(shù)同時(shí)排除常見染色體病。聯(lián)合QF-PCR的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）快速、準(zhǔn)確地診斷目標(biāo)染色體病，包括13、18、21、X和Y染色體數(shù)目，減少后續(xù)進(jìn)一步產(chǎn)前診斷的可能；（2）減少地貧產(chǎn)前診斷中遺漏染色體異常病例；（3）報(bào)告時(shí)間短，實(shí)現(xiàn)早診斷的目的，極大地減少孕婦焦慮、緊張的情緒；（4）在染色體閱片人力不足的情況下，可降低染色體核型分析檢測(cè)量、減少產(chǎn)前診斷費(fèi)用；（5）可作為染色體核型分析及染色體微陣列分析的有力補(bǔ)充[10]。因此，我們運(yùn)用QF-PCR技術(shù)檢測(cè)胎兒21、18、13、X和Y染色體作為地貧產(chǎn)前診斷中排除常見胎兒染色體病的第一選擇。

[1]朱宇寧,呂時(shí)銘.熒光定量PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2016,51(5):321-324

[2]Rostam i P,Valizadegan S,Ghalandary,et al.Prenatal Screening for Aneuploidies Using QF-PCR and Karyotyping:A Comprehensive Study in Iranian Population[J].A rch Iran M ed,2015,18(5):296-303

[3]陸國(guó)輝,徐湘民.臨床遺傳咨詢[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007.237-240

[4]Yin A,Li B,Luo M,et al.The prevalence and molecular spectrum of α-andβ-globin gene mutations in 14,332 fam ilies of Guangdong Province,China[J].PLoSOne,2014,9(2):e89855

[5]Rahil H,Solassol J,Philippe C,et al.Rapid detection ofcommon autosomal aneuploidiesby quantitative fluorescent PCR on uncultured amniocentesis[J].Eur JHum Genet,2002,10(8):462-466

[6]Atef SH,Hafez SS,Mahmoud NH,et al.Prenatal diagnosisof fetal aneuploidies using QF-PCR:the egyptian study[J].J Prenat Med, 2011,5(4):83-89

[7]Xu AQ,XiaM,Liu JT,etal.Validation ofquantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosisof common aneuploidies in the Chinese population[J].GenetMolRes,2013,12(4):6379-6388

[8]Badenas C1,Rodríguez-Revenga L,Morales C,et al.Assessment of QF-PCR as the firstapproach in prenataldiagnosis[J].JMol Diagn, 2010,12(6):828-34

[9]Baig S,Ho SS,Ng BL,etal.Developmentof quantitative-fluorescence polymerase chain reaction for the rapid prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies in 1 000 samples in Singapore [J].SingaporeMed J,2010,51(4):343-348

[10]Shin YJ,Chung JH,Kim DJ,etal.Quantitative fluorescentpolymerase chain reaction for rapid prenatal diagnosis of fetal aneup loidies in chorionic villus sampling in a single institution[J].Obstet Gynecol Sci,2016,59(6):444-453

R714.55

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.04.061

2017-03-17）