周淼，代靜靜，兌丹華，敖宇

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 普通外科，貴州 遵義563000； 2.遵義市第一人民醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室，貴州 遵義 563000）

急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥，具有較高的發(fā)病率和病死率。20%～30%患者病情較兇險，總體病死率為5%～10%[1]。SAP發(fā)生后炎癥因子大量釋放，隨后機(jī)體會代償產(chǎn)生大量抑炎因子，使機(jī)體處于免疫麻痹狀態(tài)[2]，此時腸道免疫功能受到抑制，腸道內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素向腸外組織遷移，導(dǎo)致繼發(fā)感染，甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭。清胰II號制劑是治療急性胰腺炎的有效中藥復(fù)方制劑，前期的實驗研究[3-4]表明，清胰II號制劑能有效改善重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠胰腺及胰外臟器損傷，抑制腸道細(xì)菌移位。本實驗的宗旨建立大鼠SAP模型，觀察不同處理組回腸組織的病理改變，檢測血清IL-1、IL-10的濃度及回腸高遷移率族蛋白1（HMGB1）mRNA表達(dá)，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的凋亡情況，并與谷氨酰胺進(jìn)行比較，探討中藥清胰II號對SAP大鼠腸道免疫的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。為其開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

清胰II號制劑由課題組提供，牛磺膽酸鈉購買于美國Sigma公司，10%水合氯醛由遵義醫(yī)學(xué)院提供，健康SD大鼠購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)[證書編號為SCXK（渝）2012-0005]，引物設(shè)計與合成購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，熒光定量PCR試劑盒（提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增）均購買于寶生物工程（大連）有限公司，流式細(xì)胞儀（美國BECKMAN COULTER），CD3+，CD4+，CD8+抗體均購買于Biolegend。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 選取SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡8～10周，雌雄不限，將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=8），SAP模型組（SAP組，n=24），SAP模型+清胰II號干預(yù)組（清胰II號組，n=24），SAP模型+陽性藥物谷氨酰胺干預(yù)組（谷氨酰胺組，n=24）。術(shù)前禁食12 h，不禁水，10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉動物，假手術(shù)組大鼠開腹后僅翻動腸管，其余組大鼠采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c（0.1 mL/100 g）制SAP模型；清胰II號組大鼠于SAP制模蘇醒后予清胰II號灌胃（1 mL/100 g，1次/6 h），谷氨酰胺組大鼠于SAP制模蘇醒后予谷氨酰胺灌胃（0.15 g/100 g，1次/6 h），另兩組以同樣的方式給予生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集和保存 假手術(shù)組僅在術(shù)后6 h采集標(biāo)本，其余組分別于術(shù)后6、12、24 h采集標(biāo)本。大鼠麻醉后經(jīng)原切口入腹，用促凝管由下腔靜脈取血3～5 mL，室溫擱置片刻后，3 000 r/min離心15 min，EP管收集上層血清，-80 ℃冰箱保存，備血清IL-1、IL-10的檢測，取部分回腸生理鹽水沖洗干凈，勻漿法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后-80 ℃冰箱保存，備HMGB1基因的檢查；取部分胰腺組織，10%中性福爾馬林溶液中固定，4 μm連續(xù)切片供HE染色。取末端回腸組織固定于10%中性甲醛緩沖液中，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，由專業(yè)病理醫(yī)師觀察切片，收集回腸Peyer結(jié)制備成單細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.3 胰腺組織病理學(xué)評分 在光鏡下比較各組胰腺病理學(xué)改變，按照鏡下病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，由病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲評分。

1.2.4 RT-PCR檢測回腸組織中的6、12、24 h的HMGB1 mRNA的表達(dá) 參照TaKaRa公司RNAiso Reagent試劑盒說明提取組織中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，40 個循環(huán)，末循環(huán):55 ℃ 10 min。HMGB1上游引物:5'-TGA GAA GCT GGC TGT AAT GC-3'，下游引物:5'-AAA TGG CTT GGA CAA CTG GTA-3'，擴(kuò)增長度為222 bp；β-actin上游引物:5'-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3'，下游引物:5'-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3'，擴(kuò)增長度為165 bp。

1.2.5 回腸組織的病理學(xué)檢測 取一段回腸，暴露黏膜面，用預(yù)冷生理鹽水徹底沖洗，切取5 mm×3 mm×3 mm大小回腸組織，固定于4%戊二醛固定溶液，標(biāo)本用逐級增高濃度的酒精（30%→50%→70%→80%→90%→100%）脫水2次，吸出乙醇，加入醋酸異戊酯與乙醇1:1混合液，進(jìn)行干燥及樣品導(dǎo)電處理，最后行電鏡掃描。

1.2.6 T淋巴細(xì)胞亞群的凋亡檢測 收集回腸Peyer結(jié)制備成單細(xì)胞懸液，立即按CD3+、CD4+、CD8+流式抗體試劑盒說明（CD3+、CD4+、CD8+分別由PE、PE-Cy7、APC標(biāo)記）及凋亡檢測試劑盒說明（Annexin V-FITC/PI）行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。本實驗數(shù)據(jù)定量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺組織病理學(xué)檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠胰腺組織無充血、水腫及壞死（圖1A）；SAP組胰腺腺泡腫脹、間質(zhì)水腫，大片出血及壞死灶，大量炎性細(xì)胞浸（圖1B）；清胰II號組（圖1C）及谷氨酰胺組（圖1D）大鼠胰腺組織周圍間質(zhì)均明顯水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)及毛細(xì)血管周圍中等量炎性細(xì)胞浸潤，腺泡細(xì)胞壞死較SAP模型組輕。各組術(shù)后胰腺病理學(xué)評分均明顯且逐漸升高（均P＜0.05），但兩個治療組評分在相同時間點上均明顯低于SAP組（均P＜0.05），且兩組在相同時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

圖1 各組術(shù)后6 h胰腺組織病理學(xué)檢測（HE×100） A:假手術(shù)組；B:SAP組；C:清胰II號組；D:谷氨酰胺組Figure 1 Pathological examination of the pancreatic tissues in each group at postoperative 6 h (HE×100) A:Sham operation group;B:SAP group; C:Qingyi II group; D:Glutamine group

表1 大鼠胰腺病理學(xué)評分比較（n=8，±s）Table 1 Comparison of pathological scores for pancreatic damage among groups of rats (n=8,±s)

表1 大鼠胰腺病理學(xué)評分比較（n=8，±s）Table 1 Comparison of pathological scores for pancreatic damage among groups of rats (n=8,±s)

注:1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與SAP組同時間點比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.SAP group

組別 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組 0 — —SAP 組 7.00±0.821) 11.00±0.821) 13.5±0.501)清胰II號組 4.75±0.961),2) 8.00±0.821),2)10.00±0.821),2)谷氨酰胺組 4.00±0.821),2) 8.00±0.821),2)10.00±0.821),2)

2.2 回腸組織病理學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 光鏡觀察 光鏡下假手術(shù)組回腸組織無水腫、出血及壞死，腺體結(jié)構(gòu)完整；SAP組鏡下見回腸組織結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)水腫、出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤，局部灶性壞死；兩個治療組鏡下見腸黏膜組織水腫、充血，少量中性粒細(xì)胞浸潤，程度較SAP組輕（圖2）。

圖2 各組術(shù)后6 h回腸組織病理學(xué)檢測（HE×100） A:假手術(shù)組；B:SAP組；C:清胰II號組；D:谷氨酰胺組Figure 2 Pathological examination of the ileal tissues in each group at postoperative 6 h (HE×100) A:Sham operation group; B:SAP group; C:Qingyi II group; D:Glutamine group

2.2.2 電鏡觀察結(jié)果 電鏡下見假手術(shù)組腸黏膜表面微絨毛清晰，數(shù)目多，直立、凸起，排列整齊；SAP組鏡微絨毛壞死、脫落、融合；兩個治療組回腸黏膜表面微絨毛萎縮變短，絨面間隙增寬，排列欠整齊（圖3）。

圖3 各組術(shù)后6 h回腸組織電鏡觀察（×10 000） A:假手術(shù)組；B:SAP組；C:清胰II號組；D:谷氨酰胺組Figure 3 Electron microscopic observation of the ileal tissues in each group at postoperative 6 h (×10 000) A:Sham operation group;B:SAP group; C:Qingyi II group; D:Glutamine group

2.3 血清IL-1、IL-10的濃度檢測結(jié)果

與對照組比較，其余各組術(shù)后血清IL-1、IL-10水平均明顯并逐漸升高（均P＜0.05），但兩個治療組各時間點的IL-1、IL-10的升高程度均小于SAP組（均P＜0.05），且兩組間同時間點各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。

表2 各組大鼠各時間點血清IL-1和IL-10的濃度水平（n=8，±s）Figure 2 Serum levels of IL-1 and IL-10 in each group of rats at diあerent postoperative time points (n=8,±s)

注:1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與SAP組同時間點比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.SAP group

組別 IL-1 IL-10 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組 14.4 970±0.5 019 — — 7.3 430±0.4 404 — —SAP 組 21.3 680±0.6 3491) 32.3780±2.2 8421) 44.9585±1.2 9631) 13.3606±0.5 2261) 14.9 835±0.8 7901) 19.0 393±1.1 9921)清胰II號組 18.0830±0.7 3141),2)24.7675±2.2 0481),2)32.7723±2.1 9811),2) 30.9153±1.3 3001),2)18.8363±1.2 5441),2)24.8222±2.2 1651),2)谷氨酰胺組 17.2856±1.7 1381),2)23.3280±3.4 0421),2)30.9153±1.3 3001),2) 15.6348±0.6 5731),2)18.6348±1.8 0601),2)24.8278±0.9 5121),2)

2.4 回腸HMGB1表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組比較，其余各組術(shù)后回腸組織HMGB1 mRNA相對表達(dá)量均明顯并逐漸升高（均P＜0.05），但兩個治療組各時間點的回腸組織HMGB1 mRNA相對表達(dá)量的升高程度均小于SAP組（均P＜0.05），且兩組間同時間點HMGB1 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表3）。

表3 各組各時間點大鼠回腸HMGB1 mRNA相對表達(dá)量（n=8，±s）Table 3 Relative expression levels of HMGB1 mRNA on the ileal tissues of each group of rats at diあerent postoperative time points (n=8,±s)

表3 各組各時間點大鼠回腸HMGB1 mRNA相對表達(dá)量（n=8，±s）Table 3 Relative expression levels of HMGB1 mRNA on the ileal tissues of each group of rats at diあerent postoperative time points (n=8,±s)

注:1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與SAP組同時間點比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.SAP group

組別 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組 1.0 396±0.5 626 — —SAP 組 4.1 703±1.3 1661) 35.8 489±3.00481) 63.7041±2.4 5971)清胰II號組 1.3 816±0.5 7071),2) 4.5 859±1.53871),2) 21.3879±6.0 8201),2)谷氨酰胺組 1.6 025±0.1 5041),2) 2.2 252±0.1 4051),2) 2.5953±0.1 4931),2)

2.5 各組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率

與對照組比較，其余各組術(shù)后回腸組織CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡率均明顯升高（均P＜0.05），其中SAP組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡率隨時間呈逐漸升高趨勢，但兩個治療組以上淋巴細(xì)胞的凋亡率隨時間呈逐漸降低趨勢，且各時間點均小于SAP組（均P＜0.05），此外，兩治療組間同時間點各T細(xì)胞亞群的凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表4）。

表4 各組大鼠各時間點淋巴細(xì)胞凋亡率（n=8，±s）Table 4 Apoptosis rates of T lymphocytes in each group of rats at diあerent time points (n=8,±s)

表4 各組大鼠各時間點淋巴細(xì)胞凋亡率（n=8，±s）Table 4 Apoptosis rates of T lymphocytes in each group of rats at diあerent time points (n=8,±s)

注:1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與SAP組同時間點比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.SAP group

項目 6 h 12 h 24 h CD3+假手術(shù)組 1.1 400±0.2 966 — —SAP 組 10.1 000±0.5 4311) 16.9 400±2.4 6001) 26.6 000±0.9 4071)清胰II號組 9.2 200±0.2 7721),2) 6.7 000±0.7 0361),2) 3.2 000±0.1 0001),2)谷氨酰胺組 9.1000±0.2 4491),2) 5.3400±0.7 4031),2) 3.5200±0.8 7011),2)CD4+假手術(shù)組 1.1 200±0.2 280 — —SAP 組 9.8 200±0.2 2801) 14.2 000±2.8 4431) 25.0 200±1.4 2551)清胰II號組 8.9400±0.3 6471),2) 6.9400±1.0 4071),2) 2.7 600±0.3 3621),2)谷氨酰胺組 9.0400±0.4 3931),2) 7.4200±0.1 9241),2) 2.9 200±0.1 6431),2)CD8+假手術(shù)組 1.1 600±0.1 342 — —SAP 組 10.3 400±0.6 5801) 14.9 800±3.1 4991) 27.1000±1.5 7581)清胰II號組 7.5 600±0.4 5611),2) 7.6 000±0.2 4491),2) 3.9 800±0.1 4831),2)谷氨酰胺組 7.6 800±0.3 7011),2) 7.4 400±0.2 0741),2) 3.9 600±0.3 6471),2)

3 討 論

腸黏膜屏障一般由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障構(gòu)成。多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放是造成腸黏膜屏障損傷、腸道通透性增加和腸源性感染的原因[5-8]。其中，腸道免疫屏障可以很好的避免腸道內(nèi)菌群發(fā)揮不當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，讓促炎和抗炎處于平衡之中[9]。SAP時，大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，使腸道出現(xiàn)微循環(huán)障礙，大量免疫細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腸道局部或全身免疫力下降，從而導(dǎo)致腸道發(fā)生免疫功能損傷，最終可導(dǎo)致腸道功能衰竭[10]?？梢姡l(fā)生SAP時，加強(qiáng)對腸道黏膜免疫屏障的保護(hù)，對腸黏膜屏障乃至對全身免疫功能都有積極作用。

HMGB1作為一種晚期炎癥因子[11-12]，幾乎存在于所有的細(xì)胞中。Wolfson等[13-14]研究發(fā)現(xiàn):用HMGB1處理腸上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后，可引起單層細(xì)胞屏障功能喪失。Luan等[15]的研究表明，AP大鼠腸黏膜中HMGB1含量明顯升高。Yang等[16]的研究顯示含HMGB1的膽汁可破壞腸黏膜屏障。上述研究均證實HMGB1介導(dǎo)了SAP時IBFD的發(fā)病過程，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。SAP時存在T淋巴細(xì)胞亞群變化[17]。喬世峰等[18]研究了SAP大鼠腸道免疫功能的變化，發(fā)現(xiàn)SAP發(fā)生后各期CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯下降，說明大鼠早期即發(fā)現(xiàn)腸黏膜免疫功能明顯下降。王興鵬等[19-20]的研究發(fā)現(xiàn)ANP大鼠回腸Peyer集合淋巴結(jié)中存在大量凋亡淋巴細(xì)胞，亦證明了SAP大鼠存在腸道免疫屏障受損。

HMGB1是眾所周知的危險相關(guān)分子模式或警報素，能夠激活先天性免疫反應(yīng)。HMGB1可激活樹突狀細(xì)胞并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，成熟樹突狀細(xì)胞通過淋巴管遷移到淋巴結(jié)，將其在外周組織獲得的外源性抗原提呈給未致敏T細(xì)胞，從而啟動免疫反應(yīng)。董寧等[21]研究顯示，大面積燒傷患者傷后HMGB1含量與T淋巴細(xì)胞免疫功能障礙相關(guān)。另有研究[22]發(fā)現(xiàn)HMGB1能顯著誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)TLR4下調(diào),進(jìn)而參與調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性。以上研究表明HMGB1不僅對T淋巴細(xì)胞免疫功能具有直接調(diào)節(jié)作用，還可通過影響細(xì)胞免疫中其它重要細(xì)胞的功能繼而間接地調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能。近年來，從細(xì)胞免疫角度探討HMGB1與IBFD的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。

HMGB1不僅是種晚期炎性因子，同時也是一種免疫調(diào)節(jié)因子。前期實驗[23]已經(jīng)證實在SAP時，大鼠血HMGB1隨時間推移，不斷升高。本實驗顯示，HMGB1介導(dǎo)并參與了SAP及IBFD病程的發(fā)展，隨病程的進(jìn)展，回腸HMGB1 mRNA表達(dá)量越來越高，同時，血清IL-1、IL-10濃度及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡越來越高。HMGB1可能通過對CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)，從細(xì)胞免疫途徑介導(dǎo)并參與SAP時腸免疫功能障礙的發(fā)生。

清胰II號制劑是治療急性胰腺炎的有效中藥復(fù)方制劑，前期的實驗研究[24]表明，清胰II號制劑能有效改善SAP大鼠胰外臟器損傷，對腸屏障功能具有良好的保護(hù)作用。在肖青川等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠予清胰II號治療后，其回腸HMGB1 mRNA表達(dá)量下調(diào)，移位細(xì)菌數(shù)量減少，回腸病理改變減輕，說明清胰II號可能通過下調(diào)回腸HMGB1 mRNA表達(dá)，從而改善腸道功能。

本研究顯示，SAP模型組胰腺病理評分與假手術(shù)組相比均明顯升高，模型復(fù)制成功；隨著病程時間的延長，胰腺病理損傷越來越重，予以清胰II號及谷氨酰胺干預(yù)治療后，各組各對應(yīng)時間點胰腺病理評分均較SAP組降低，說明治療有效，且兩組治療效果無明顯差異。IL-1、IL-10濃度顯示，SAP組各時間點較假手術(shù)組升高，兩個治療組較SAP組各時間點下降，但兩個治療組各對應(yīng)時間點無統(tǒng)計學(xué)差異，說明清胰II號和谷氨酰胺均可以有效降低炎癥介質(zhì)。清胰II號及谷氨酰胺灌胃后，各時間點回腸HMGB1 mRNA表達(dá)量均較模型組下降，各時間點CD3+、CD4+、CD8+的凋亡率較模型組下降，回腸病理損傷較模型組減輕。隨著用藥時間的延長，各時間點各T細(xì)胞的凋亡率呈下降趨勢，表明兩種藥物均能時間抑制腸道淋巴細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，重癥急性胰腺炎時，大量炎癥因子釋放，腸道屏障功能受損，在SAP并IBFD的過程中，HMGB1作為晚期炎性因子及免疫刺激因子參與其中，HMGB1可能通過對腸道T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)，從細(xì)胞免疫途徑介導(dǎo)腸黏膜免疫屏障功能障礙，促進(jìn)SAP的病情進(jìn)展。清胰II號制劑對SAP大鼠腸黏膜免疫屏障功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低機(jī)體HMGB1的表達(dá)，使CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡減少，從而改善SAP時腸道免疫功能。

參考文獻(xiàn)

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