李亞萍，鄒余糧，張琳，黃新，秦勇

(1西安市中心醫(yī)院，西安710003；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

卵巢癌HELQ蛋白結(jié)構(gòu)和功能的生物信息學(xué)工具分析預(yù)測

李亞萍1，鄒余糧2，張琳1，黃新1，秦勇1

(1西安市中心醫(yī)院，西安710003；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的預(yù)測卵巢癌抑癌基因HELQ編碼蛋白(HELQ蛋白)的結(jié)構(gòu)和功能。方法采用ExPASy服務(wù)器中的工具分析HELQ蛋白的理化特征。分別采用PSORTⅡ和TMHMM預(yù)測HELQ蛋白的亞細(xì)胞定位和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。采用SignalP 4.0預(yù)測HELQ蛋白的信號肽。采用ScanProsite和SMART分析HELQ蛋白的功能結(jié)構(gòu)域以及結(jié)構(gòu)域分區(qū)。采用PSIPRED和I-TASSER預(yù)測HELQ蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)以及配體結(jié)合位點(diǎn)。采用STRING 10.0預(yù)測HELQ蛋白與其他蛋白的交互作用。結(jié)果HELQ蛋白主要定位在細(xì)胞核(47.8%)和細(xì)胞質(zhì)(39.1%)中，有4個保守結(jié)構(gòu)域DEXDc、HELICc、HHH_5和PRK02362，并包含解旋酶ATP結(jié)合區(qū)和解旋酶C端結(jié)合區(qū)兩個功能結(jié)構(gòu)域；成功建立了HELQ蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)模型，其中二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、無規(guī)則卷曲及折疊結(jié)構(gòu)比例分別為54%、31%和6%。三維配體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)HELQ蛋白包含一個酶活性中心位點(diǎn)His341，催化Ile333、Lys335、Tyr337、Gln340、Pro360、Thr361、Ser362、Gly363、Gly364、Lys365、Thr366、Leu367、Glu464和Ala711等結(jié)合位點(diǎn)與配體ATP結(jié)合。交聯(lián)蛋白質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)HELQ蛋白可能與RAD51、POLA1、PLON、FANCD2、DHX8等蛋白存在交互作用。結(jié)論HELQ蛋白可能具有ATP依賴性解旋酶的結(jié)構(gòu)和功能，參與DNA損傷的修復(fù)過程。

卵巢癌；HELQ基因；HELQ蛋白；三級結(jié)構(gòu)；ATP依賴性解旋酶

Abstract:ObjectiveTo predict the structure and function of ovarian cancer anti-tumor gene HELQ protein.MethodsThe tools of ExPASy Server were employed to analyze the physicochemical properties of HELQ protein. Its subcellular localization and transmembrane topology were predicted by PSORTⅡand TMHMM, respectively. The signal peptide of HELQ was predicted by SignalP 4.0. ScanProsite and NCBI conserved domain search data were used to analyze the function domain and conserved domain. PSIPRED and I-TASSER were employed to construct the secondary structure and three-dimensional model and find the ligand binding sites of HELQ. STRING 10.0 was used to predict the interaction of HELQ with other proteins.ResultsThe HELQ protein was mainly located in the nucleus (47.8%) and cytoplasm (39.1%). HELQ had 4 conserved domains, consisting of DEAD, HELICc, HHH_5, and PRK02362, and contained 2 function domains: Helicase_ATP-Bind_1 and Helicase_Cter. The secondary structure and three-dimensional model were constructed. In the secondary structure, HELQ was composed of α helix (54%), random coils (31%), and 10.26% β-structure. The results of three-dimensional model found that HELQ had a enzyme activity site His341 and the ligand binding sites appeared in Ile333, Lys335, Tyr337, Gln340, Pro360, Thr361, Ser362, Gly363, Gly364, Lys365, Thr366, Leu367, Glu464 and Ala711 which combined with ATP. The result of cross-linked protein analysis discovered that HELQ might be interaction with RAD51, POLA1, PLON, FANCD2, and DHX8.ConclusionHELQ protein may have ATP-dependent helicase structure and function, and participate in the DNA damage repair process.

Keywords: ovarian carcinoma; HELQ gene; HELQ protein; tertiary structure; ATP-dependent helicase

卵巢癌是女性常見癌癥的第二大殺手，早期難以診斷，且預(yù)后效果較差，5年生存率約47%[1]。對卵巢癌發(fā)生的相關(guān)基因的研究，能夠?yàn)樵缙谠\斷和靶向治療卵巢癌提供方向。HELQ基因是2013年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的卵巢癌抑癌基因，該基因缺失時會增加小鼠患卵巢癌的風(fēng)險[2]。已有研究表明，HELQ基因可以修復(fù)細(xì)胞增殖時DNA復(fù)制過程中發(fā)生的DNA損傷，如果該基因發(fā)生缺陷或缺失，DNA錯誤復(fù)制的可能性會增加，從而提高惡性腫瘤發(fā)生的幾率[3]。因而筆者推測，如果HELQ基因在人類和小鼠中的作用一致，未來或許可通過篩查HELQ基因來診斷和治療女性卵巢癌。但縱觀國內(nèi)外研究，關(guān)于該基因的研究尚不夠成熟，該基因表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)及功能也不明確。本研究利用生物信息學(xué)工具預(yù)測HELQ基因編碼蛋白(HELQ蛋白)的結(jié)構(gòu)和功能?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 HELQ基因序列的來源 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取HELQ基因的核苷酸序列，其Genbank序號為AF436845.1，Gene ID:113510，定位于染色體4q21上。HELQ基因又稱HEL308，全長3591 bp，ORF finder分析HELQ基因序列包含17個開放閱讀框，其中ORF3編碼基因的全長，共1101個氨基酸。

1.2 HELQ蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測 用ExPASy服務(wù)器[4]中的ProtParam、Compute pI/Mw和ProtScale軟件預(yù)測HELQ蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性/親水性、不穩(wěn)定系數(shù)及脂肪系數(shù)等。用PSORTⅡ(http://www.genscript.com/psort.html)預(yù)測HELQ蛋白的亞細(xì)胞定位。用TMHMM軟件[5]預(yù)測HELQ蛋白的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。用SignalP4.0 Server軟件[6]預(yù)測HELQ蛋白的信號肽。用ScanProsite軟件[7]預(yù)測HELQ蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫[8]分析蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。用PSIPRED序列分析軟件[9]預(yù)測HELQ蛋白的二級結(jié)構(gòu)。用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模工具I-TASSER[10～13]構(gòu)建HELQ蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，并分析其配體結(jié)合位點(diǎn)及其配體。使用STRING 10.0軟件[14]分析HELQ蛋白與其他蛋白交聯(lián)的相互作用。軟件使用方法參照軟件使用說明書或自帶的使用教程。

2 結(jié)果

2.1 HELQ蛋白的理化性質(zhì) Prot Param軟件計算出HELQ蛋白的分子量約為124 175.3 Da，理論等電點(diǎn)為6.12，氨基酸組成中酸性氨基酸多于堿性氨基酸，且亮氨酸(Leu)比例最高(12.4%)；不穩(wěn)定指數(shù)為45.55，故推測HELQ應(yīng)為不穩(wěn)定的酸性蛋白。Prot Scale軟件計算出HELQ蛋白疏水性指數(shù)平均值為-0.317，脂肪族指數(shù)為92.34，說明其為親脂性蛋白。

2.2 HELQ蛋白亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域 PSORTⅡ軟件計算出HELQ蛋白最大可能分布在細(xì)胞核(47.8%)和細(xì)胞質(zhì)(39.1%)中，也可能出現(xiàn)在線粒體及囊泡分泌系統(tǒng)(高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu))中，TMHMM和SignalP4.0計算結(jié)果顯示HELQ蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，說明該蛋白可能不是跨膜蛋白及內(nèi)分泌蛋白，而可能是代謝調(diào)控蛋白或轉(zhuǎn)錄因子。

Scan Prosite軟件預(yù)測HELQ蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示HELQ蛋白包含兩個功能結(jié)構(gòu)域，分別是Helicase_ATP-Bind_1(解旋酶ATP結(jié)合區(qū)A)和Helicase_Cter(解旋酶C端結(jié)合區(qū))，其功能分別是結(jié)合和水解ATP。通過查找NCBI 保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)HELQ序列有4個保守結(jié)構(gòu)域，分別是DEAD(解旋酶家族成員之一)、HELICc(解旋酶C端超級結(jié)構(gòu)域)、HHH-5(復(fù)合螺旋結(jié)構(gòu)域)和PRK02362(ski2_like結(jié)構(gòu)域)，其中DEAD參與各種RNA代謝過程，包括核轉(zhuǎn)錄、前信使RNA剪接、核糖體合成、核質(zhì)運(yùn)輸、翻譯、RNA衰變以及細(xì)胞器基因的表達(dá)。

2.3 HELQ蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu) PSIPRED軟件構(gòu)建出的HELQ蛋白二級結(jié)構(gòu)模型顯示HELQ蛋白由α-螺旋(54%)和無規(guī)則卷曲(31%)、 β-折疊(6%)組成。I-TASSER軟件構(gòu)建出了HELQ蛋白三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)合3DLigandsite軟件建立HELQ蛋白三維配體結(jié)合模型，發(fā)現(xiàn)其可能結(jié)合的配體為ATP，結(jié)合位點(diǎn)為Ile333、Lys335、Tyr337、Gln340、360Pro、361Thr 、Ser362、Gly363、Gly364、Lys365、Thr366、Leu367、464Glu、711Ala，且主要分布在Helicase_ATP-Bind_1和Helicase_Cter兩個功能結(jié)構(gòu)域；另外，結(jié)合位點(diǎn)中心區(qū)域的His341為HELQ蛋白的酶活性中心位點(diǎn)，因此，推測HELQ的活性依賴于與ATP結(jié)合從而提供的能量。

2.4 HELQ蛋白的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò) STRING 10.0交互式數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)交聯(lián)分析結(jié)果顯示與HELQ蛋白相互作用的蛋白主要有RAD51、POLA1、PLON、FANCD2、DHX8 等。其中RAD51具有DNA依賴的ATP酶活性，參與同源重組和雙鏈斷裂時的DNA損傷修復(fù)的激活；PLON是一種DNA聚合酶；FANCD2參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)過程，維持染色體的穩(wěn)定。而HELQ與這些蛋白存在交互作用，因此推測HELQ的功能作用與這些蛋白相似，也與DNA復(fù)制有關(guān)，即可能參與修復(fù)細(xì)胞增殖時DNA復(fù)制過程中所發(fā)生的的DNA損傷。

3 討論

DNA修復(fù)是細(xì)胞對DNA損傷的一種反應(yīng)，可使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)重新執(zhí)行原來的功能。若DNA的損傷未被完全消除，且細(xì)胞能夠耐受這種損傷繼續(xù)生存，那么該DNA損傷有很大幾率會在適合的條件下顯示出來，如導(dǎo)致細(xì)胞癌變。因此，DNA損傷修復(fù)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNA解旋酶可以修復(fù)核苷酸的錯配、雙鏈斷裂及同源重組交叉反應(yīng)等DNA損傷，對于維持機(jī)體基因及染色體的穩(wěn)定至關(guān)重要。不同的解旋酶(如RuvAB、RecBCD、RecQ1等)修復(fù)不同的DNA損傷[15,16]。研究已經(jīng)證實(shí)小鼠體內(nèi)該基因的缺失可以提高卵巢癌的發(fā)病率[2]。Moldovan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，人的HELQ蛋白表達(dá)缺失同樣可以引起DNA復(fù)制過程受阻，且其他研究[18]也進(jìn)一步證實(shí)HELQ蛋白是一種依賴ATP的酶，具有DNA解旋酶活性，參與細(xì)胞的增殖過程。本研究結(jié)果顯示，HELQ蛋白包含Helicase_ATP_Bind 1和 Helicase_Cter兩個中心區(qū)域，功能分別是結(jié)合和水解ATP，行使解旋酶的活性；蛋白質(zhì)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)與HELQ相互交聯(lián)的蛋白均具有修復(fù)DNA損傷的功能，其中RAD51協(xié)同同系產(chǎn)物(如RAD51B、RAD51D)在DNA損傷的末端形成核蛋白絲，催化斷裂的DNA雙鏈與同源DNA姐妹鏈進(jìn)行鏈間重組交換，從而維持基因的穩(wěn)定性[19]。RAD51是DNA 同源重組修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶，與BRCA1、BRCA2相互協(xié)作，干擾DNA損傷修復(fù)，引起基因組的不穩(wěn)定性，誘導(dǎo)乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生[20,21]。PLON是由POLH基因編碼的DNA聚合酶ν，修復(fù)紫外輻射導(dǎo)致的DNA嘧啶二聚體，使DNA的復(fù)制正常進(jìn)行[18]。FANCD2在應(yīng)對DNA損傷時第561位的賴氨酸單泛素化，在核中特定位點(diǎn)與FA通路下游相關(guān)修復(fù)蛋白共定位，修復(fù)損傷DNA。FANCD2基因是FA通路的關(guān)鍵基因，若缺失則導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)功能障礙，引發(fā)癌癥[22,23]。HDX8是一種依賴ATP的RNA解旋酶。因此推測HELQ 蛋白也具有解旋酶的功能。

已有研究表明人類HELQ蛋白在卵巢、精巢、心臟及骨骼肌均表達(dá)，且HELQ蛋白表達(dá)與生殖細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。HELQ基因發(fā)生突變后，導(dǎo)致男性出現(xiàn)少精、唯支持細(xì)胞綜合癥、女性卵巢功能不全而不孕[24,25]。目前的研究集中于對HELQ蛋白功能的探索，Ward等[26]研究發(fā)現(xiàn)HELQ聯(lián)合RAD51修復(fù)減數(shù)分裂時DNA雙鏈的斷裂。Luebben等[27]研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物的HELQ蛋白具有維持基因穩(wěn)定的功能。但其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系需進(jìn)一步研究。Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)HELQ激活與DNA損傷相關(guān)的CHK1-RAD51，抑制骨肉瘤的生長；敲除HELQ基因?qū)е鹿侨饬龅脑鲋澈瓦w移能力增強(qiáng)。因此推測人類HELQ蛋白表達(dá)的缺失可能引起惡性腫瘤尤其是生殖系統(tǒng)腫瘤卵巢癌的發(fā)生。

本研究對HELQ蛋白的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了分析，初步推測其可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的DNA損傷修復(fù)過程，從而影響惡性腫瘤細(xì)胞的增殖以及腫瘤治療過程中的治療效果。HELQ基因和蛋白與卵巢癌的關(guān)系有進(jìn)一步研究的價值。

[1] Wagener J，Seybold U. MRSA - Hygiene-Management, Diagnostik und Therapie[J].Dtsch Med Wochenschr, 2014,139(13):643-654.

[2] Adelman CA, Lolo RL, Birkbak NJ, et al. HELQ promotes RAD51 paralogue-dependent repair to avert germ cell loss and tumorigenesis[J]. Nature, 2013,502(7471):381-384.

[3] Dolgova EV, Alyamkina EA, Efremov YR, et al. Identification of cancer stem cells and a strategy for their elimination[J]. Cancer Biol Ther, 2014,15(10):1378-1394.

[4] Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M].Clifton:Humana Press, 2005:571-607.

[5] Moller S, Croning R, Apweiler R. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions[J]. Bioinformatics, 2002,18(1): 218-218.

[6] Petersen TN, Brunak S, von Heijne G, et al. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Meth, 2011,8(10):785-786.

[7] Sigrist CJ, Castro E, Cerutti L, et al. New and continuing developments at PROSITE[J]. Nucl Acid Res, 2012,41:D334-337.

[8] Marchler-Bauer A, Bo Y, Han L, et al. CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures[J]. Nucl Acid Res, 2017,45(D1):D200-D203.

[9] Buchan DW, Minneci F, Nugent TC, et al. Scalable web services for the PSIPRED Protein Analysis Workbench[J]. Nucl Acid Res, 2013,41(1):349-357.

[10] Yang J, Yan R, Roy A, et al. The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction[J]. Nature Meth, 2015,12(1):7-8.

[11] Yang J, Zhang Y. I-TASSER server: new development for protein structure and function predictions[J]. Nucl Acid Res, 2015,43(1):174-181.

[12] Roy A, Kucukural A, Zhang Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction[J]. Nature Prot, 2010,5(4):725-738.

[13] Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction[J]. BMC Bioinform, 2008,9(1):40.

[14] Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, et al. STRING v10: protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life[J]. Nucl Acid Res, 2014,43(7):447-452.

[15] Spies M. DNA Helicases and DNA Motor Proteins[M]. New York:Springer, 2013:973.

[16] Viziteu E, Klein B, Basbous J, et al. RECQ1 helicase is involved in replication stress survival and drug resistance in multiple myeloma[J]. Leukemia, 2017,26(3):125-128.

[17] Moldovan GL, Madhavan MV, Mirchandani KD, et al. DNA polymerase POLN participates in cross-link repair and homologous recombination[J]. Mol Cell Biol, 2010,30(4):1088-1096.

[18] Tafel AA, Wu L, McHugh PJ. Human HEL308 localizes to damaged replication forks and unwinds lagging strand structures[J]. J Biol Chem, 2011,286(18):15832-15840.

[19] Wang AT, Kim T, Wagner JE, et al. A dominant mutation in human RAD51 reveals its function in DNA interstrand crosslink repair independent of homologous recombination[J]. Mol Cell, 2015,59(3):478-490.

[20] 彭亞婷,梅金紅.Rad51與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2011,27(1):86-89.

[21] 高麗麗,朱長樂.乳腺癌中Chk2,p53和Rad51的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(3):308-311.

[22] 劉超,高軍麗,樂貽軍,等.FANCD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].胃腸病學(xué),2014,24(7):404-407.

[23] Lambert MW，Sridharan D，Zhang P. FANCF, a Fanconi anemia core complex protein involved in monoubiquitination of FANCD2, also has a role with nuclear alpha spectrin in DNA interstrand crosslink repair[J]. Cancer Res,2016,35(2):257-259.

[24] Wang W, Zhao S, Zhuang L, et al. The screening of HELQ gene in Chinese patients with premature ovarian failure[J]. Rep Biomed Online, 2015,31(4):573-576.

[25] Pelttari LM, Kinnunen L, Kiiski JI, et al. Screening of HELQ in breast and ovarian cancer families[J].Fam Cancer, 2016,15(1):19-23.

[26] Ward JD, Muzzini DM, Petalcorin MIR, et al. Overlapping mechanisms promote postsynaptic RAD-51 filament disassembly during meiotic double-strand break repair[J]. Mol Cell, 2010,37(2):259-272.

[27] Luebben SW, Kawabata T, Akre MK, et al. Helq acts in parallel to Fancc to suppress replication-associated genome instability[J]. Nucl Acid Res, 2013,41(22):10283-10297.

[28] Liu DN, Zhou YF, Peng AF, et al. HELQ reverses the malignant phenotype of osteosarcoma cells via CHK1-RAD51 signaling pathway[J]. Oncol Re, 2017,37(2):1107-1113.

Bioinformatics analysis and prediction of HELQ protein structure and function

LIYaping1,ZOUYuliang,ZHANGLin,HUANGXin,QINYong

(1Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.009

R737.3

A

1002-266X(2017)35-0029-04

2017-03-22)

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2013JM4064)。