安波，焦文靜，張金艷，王麗虹，劉永春，馬鳴

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院, 石家莊 050011)

原發(fā)性血小板增多癥患者的骨髓病理學(xué)、染色體及JAK2-V617F基因和Bcr-abl(p210)基因表達(dá)觀察

安波，焦文靜，張金艷，王麗虹，劉永春，馬鳴

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院, 石家莊 050011)

目的觀察原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者的骨髓病理學(xué)特點(diǎn)、染色體變化及JAK2-V617F基因和融合基因Bcr-abl(p210)的表達(dá)情況。方法55例ET患者，分別行骨髓涂片檢查及骨髓組織病理檢查，同時(shí)對(duì)骨髓組織的染色體及JAK2-V617F基因、融合基因Bcr-abl(p210)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果55例患者中，骨髓涂片觀察見骨髓增生活躍34例、增生明顯活躍2例、增生低下19例；5例骨髓取材時(shí)出現(xiàn)干抽；所有患者粒、紅兩系均未見明顯病態(tài)造血，且原始細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均lt;5%；巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為122(0～561)個(gè)；41例可見明顯巨核系病態(tài)造血；所有患者血小板呈大堆分布，并可見大血小板。 55例患者中，骨髓組織病理學(xué)觀察3例可見骨髓基質(zhì)出血、水腫,造血組織容量中位數(shù)為55%；所有患者粒系增生活躍，12例紅系增生偏低下；6例可見前體細(xì)胞定位紊亂；所有患者巨核細(xì)胞有不同程度異常增生；52例可見明顯巨核系病態(tài)造血；32例可見小巨核細(xì)胞，但未見淋巴樣小巨核細(xì)胞。骨髓組織切片Gomori染色52例呈陽(yáng)性，其中35例骨髓網(wǎng)狀纖維輕度增生(+～++)、17例骨髓明顯纖維化(≥+++)。 所有患者骨髓組織未發(fā)現(xiàn)Ph染色體，但其中2例可見核型異常。55例患者中，JAK2-V617F基因突變35例，全部患者Bcr-abl(p210)基因檢測(cè)均為陰性。結(jié)論ET患者骨髓病理學(xué)特點(diǎn)是巨核細(xì)胞系明顯增生，并具有病態(tài)造血表現(xiàn)，部分患者有JAK2-V617F基因突變。骨髓組織病理檢查應(yīng)作為ET必需的診斷方法。

血小板增多癥；原發(fā)性血小板增多癥；骨髓病理學(xué)；巨核細(xì)胞；染色體；融合基因；JAK2-V617F基因；Bcr-abl(p210)基因

原發(fā)性血小板增多癥(ET)是臨床常見的骨髓增殖性腫瘤，主要表現(xiàn)為骨髓巨核細(xì)胞的增多、血小板持續(xù)增高，并伴有一系列臨床癥狀。本病起病較為隱匿，易誤診。目前其臨床診斷主要依靠患者病史、臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查及分子生物學(xué)檢查等。國(guó)內(nèi)對(duì)于ET的骨髓病理學(xué)改變報(bào)道較少?；诖耍覀儗?duì)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院收治的55例ET患者的骨髓病理學(xué)、染色體及JAK2-V617F基因和融合基因Bcr-abl(p210)的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，以探討ET的有效診斷方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2016年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院收治的ET患者55例，男16例，女39例；齡17～76歲。均表現(xiàn)為外周血血小板計(jì)數(shù)明顯升高，確診為ET ，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[1]。55例患者的外周血WBC中位數(shù)12.33×109/L (5.1～42.7×109/L)、血紅蛋白中位數(shù)138 g/L (68～192) g/L、血小板計(jì)數(shù)的中位數(shù)為963×109/L (507×109/L～2 312×109/L)；其中WBC計(jì)數(shù)增高(gt;9.5×109/L)患者37例，血紅蛋白增高(女gt;150 g/L，男g(shù)t;175 g/L)患者12例，貧血(血紅蛋白女lt;115 g/L，男l(wèi)t;130 g/L)患者3例，4例外周血涂片發(fā)現(xiàn)幼稚粒細(xì)胞。

1.2 骨髓病理學(xué)檢查 常規(guī)于髂后上棘穿刺抽取骨髓液涂片，骨髓涂片采用Wright-Giemsa染液常規(guī)染色，觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用骨髓活檢針(B65-01)于髂后上棘采集骨髓活組織。骨髓活組織塊用苦味酸固定液固定2 h后，酒精梯度脫水，采用Hemapun系列塑料包埋劑進(jìn)行包埋，制成4 μm厚切片，分別進(jìn)行HE及Gomori染色；在OLIMPUS BX51光學(xué)顯微鏡下對(duì)骨髓切片進(jìn)行常規(guī)觀察；造血組織容量采用網(wǎng)形目鏡測(cè)微器記點(diǎn)法計(jì)算，Gomori陽(yáng)性密度分級(jí)參考文獻(xiàn)[2]。

1.3 骨髓染色體及JAK2-V617F基因、Bcr-abl(p210)基因的檢測(cè) 抽取患者骨髓液常規(guī)進(jìn)行染色體核型分析，以R+G方式顯帶。并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)突變JAK2-V617F基因、融合基因Bcr-abl(p210)，以目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)×100%gt;1%作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓涂片觀察結(jié)果 55例患者中，骨髓增生活躍34例，增生明顯活躍2例，增生低下19例。5例患者取材時(shí)出現(xiàn)干抽。所有患者粒、紅兩系均未見明顯病態(tài)造血，且原始細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均lt;5%。全片巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為122(0～561)個(gè)，以顆粒、產(chǎn)板型巨核細(xì)胞為主。41例可見明顯巨核系病態(tài)造血(檢出率為74.55%)，以巨大、過(guò)度及不規(guī)則分葉核為主，21例可見小巨核細(xì)胞，但未見淋巴樣小巨核細(xì)胞，1例可見單圓及多圓核細(xì)胞。所有患者血小板呈大堆分布，并可見大血小板。

2.2 骨髓病理學(xué)觀察結(jié)果 55例患者中，3例可見骨髓基質(zhì)出血、水腫,造血組織容量中位數(shù)為55%(13%～85%)；所有患者粒系增生活躍，12例紅系增生偏低下；6例可見前體細(xì)胞定位紊亂；所有患者巨核細(xì)胞有不同程度異常增生(巨核細(xì)胞gt;10個(gè)/高倍鏡視野)，其中28例巨核細(xì)胞呈片狀分布(巨核細(xì)胞gt;30個(gè)/高倍鏡視野)；52例可見明顯巨核系病態(tài)造血(檢出率為94.55%)，以巨大、過(guò)度及不規(guī)則分葉核為主，32例可見小巨核細(xì)胞，但未見淋巴樣小巨核細(xì)胞，5例可見單圓核及多圓核。骨髓病理學(xué)檢查檢出的巨核系病態(tài)造血、巨大和過(guò)度及不規(guī)則分葉核、小巨核細(xì)胞、單圓及多圓核細(xì)胞例數(shù)與骨髓涂片的檢出例數(shù)相比，P均lt;0.05。

骨髓切片Gomori染色顯示，52例呈陽(yáng)性，其中35例為網(wǎng)狀纖維輕度增生(+～++)，17例骨髓可見明顯纖維化(≥+++)。

2.3 骨髓染色體、JAK2-V617F基因和Bcr-abl(p210)基因檢測(cè)結(jié)果及其與患者骨髓病理特點(diǎn)的關(guān)系 所有患者未發(fā)現(xiàn)Ph染色體，但其中2例可見核型異常，其表型分別為46XX，del(16)(q22)和47XY，+9。55例患者中，35例檢測(cè)到JAK2-V617F基因(63.64%)，均未檢測(cè)到融合基因Bcr-abl(p210)。檢測(cè)到JAK2-V617F基因的35例患者，造血組織容量(中位數(shù))為52%，前體細(xì)胞定位紊亂4例，巨核細(xì)胞片狀分布18例，過(guò)度及不規(guī)則分葉核巨核細(xì)胞33例，小巨核細(xì)胞20例，單圓及多圓核細(xì)胞3例，骨髓纖維化(≥+++)10例；20例JAK2-V617F基因未突變患者中，造血組織容量(中位數(shù))為58%，前體細(xì)胞定位紊亂2例，巨核細(xì)胞片狀分布10例，過(guò)度及不規(guī)則分葉核巨核細(xì)胞19例，小巨核細(xì)胞12例，單圓及多圓核細(xì)胞2例，骨髓纖維化(≥+++)7例；兩者相比，P均gt;0.05。

3 討論

ET多見于50～60歲的女性[3]，臨床表現(xiàn)主要有頭暈、乏力、血栓形成等，脾臟腫大也是常見表現(xiàn)[4]。本組55例患者中，女性明顯多于男性，患者中位年齡為50歲，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。本組患者骨髓涂片中原始細(xì)胞分類計(jì)數(shù)未見明顯異常，紅系、粒系均未見明顯病態(tài)造血，而巨核細(xì)胞則明顯增多，且以顆粒、產(chǎn)板巨核細(xì)胞為主，胞體巨大且胞質(zhì)豐富。骨髓巨核細(xì)胞病態(tài)造血是ET的重要表現(xiàn)，比巨核細(xì)胞數(shù)量增多更具有診斷意義。我們?cè)诠撬柰科肮撬杌顧z切片中均發(fā)現(xiàn)，大部分患者呈現(xiàn)明顯的巨核系病態(tài)造血，其中以巨大、過(guò)度及不規(guī)則分葉核細(xì)胞最為常見，部分患者的骨髓也可觀察到小巨核細(xì)胞，并偶可見到單圓及多圓核巨核細(xì)胞，但所有患者并未觀察到淋巴樣小巨核細(xì)胞。淋巴樣小巨核細(xì)胞一般僅見于急性巨核細(xì)胞白血病和骨髓異常增生綜合征等。因此，對(duì)小巨核細(xì)胞形態(tài)的鑒別有助于ET的診斷。本組55例患者的粒系、紅系則未見到明顯病態(tài)造血現(xiàn)象，但少部分患者可見到前體細(xì)胞定位紊亂。

在本組患者中，我們發(fā)現(xiàn)絕大部分患者的骨髓切片出現(xiàn)不同網(wǎng)狀纖維增生，這可能是由于過(guò)度增生的巨核細(xì)胞或血小板釋放血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β及表皮生長(zhǎng)因子等纖維母細(xì)胞刺激因子等導(dǎo)致纖維組織增生[4]，大多數(shù)為網(wǎng)狀纖維輕度增生，而30.91%的患者骨髓出現(xiàn)明顯纖維化。上述結(jié)果提示，在伴明顯纖維化ET的診斷過(guò)程中，需與原發(fā)性骨髓纖維化(IMF)相鑒別，但I(xiàn)MF患者骨髓切片中易出現(xiàn)明顯膠原變性，且增多的巨核細(xì)胞往往體積較小[6]。在本組患者中，其骨髓均未發(fā)現(xiàn)明顯膠原變性，并且主要以巨大、過(guò)度及不規(guī)則分葉核為主。這也提示在ET患者的骨髓液抽取過(guò)程中，可能由于骨髓纖維化而出現(xiàn)干抽。因此，在ET診斷過(guò)程中需要結(jié)合骨髓涂片和骨髓活檢的檢查結(jié)果，以達(dá)到互補(bǔ)的作用。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)本組55例患者骨髓活檢對(duì)巨核細(xì)胞病態(tài)造血檢出率明顯高于骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，這進(jìn)一步說(shuō)明骨髓活檢是骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的有力補(bǔ)充，在ET診斷中具有重要意義。

本組55例中有63.64%的患者骨髓組織有JAK2-V617F基因突變，JAK2-V617F基因的突變是MPN較為特異的分子標(biāo)志之一，在ET診斷中也具有重要意義[7-11]。如果患者骨髓組織檢測(cè)到JAK2-V617F基因突變，外周血血小板計(jì)數(shù)持續(xù)大于450×109/L，并且骨髓巨核細(xì)胞系增生明顯活躍者，即可診斷ET[8,12]。融合基因BCR-Abl(p210)是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)特異性分子標(biāo)志之一。JAK2-V617基因與BCR-ABL(p210)基因聯(lián)合檢測(cè)不僅可區(qū)分ET和繼發(fā)性血小板增多癥，而且還可排除CML引起的血小板增多。為進(jìn)一步探討JAK2-V617F基因突變與ET骨髓病理改變之間有無(wú)相關(guān)性，我們還對(duì)比分析了JAK2-V617F基因突變患者和JAK2-V617F基因未突變患者的骨髓病理特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組骨髓造血組織容量、前體細(xì)胞定位紊亂、巨核系病態(tài)造血及骨髓纖維化的例數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示JAK2-V617F基因突變可能與ET患者骨髓特征性病理改變無(wú)明顯相關(guān)。

文獻(xiàn)[9]報(bào)道個(gè)別ET患者還可有非特異性核型異常。本組患者均進(jìn)行了染色體檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2例核型異常，而Ph染色體檢測(cè)均為陰性。ET發(fā)病緩慢、預(yù)后較好，其準(zhǔn)確診斷尤為重要。盡管診斷ET需多種檢驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，但由于其病理變化具有明顯特點(diǎn)，筆者認(rèn)為骨髓病理檢查應(yīng)作為必需的診斷方法。

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馬鳴(E-mail: maming19830419@163. com )

2017-07-20)