朱小鳳，黃純蘭，李曉明

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外源性Shh蛋白對(duì)骨髓造血干細(xì)胞增殖的影響

朱小鳳，黃純蘭，李曉明

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)聯(lián)合外源性Shh蛋白干預(yù)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞(HSC)增殖的影響。方法分別采用全骨髓培養(yǎng)法、磁珠分選法(MASC)從正常志愿者骨髓中分離BMMSC、HSC，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。將分選好的HSC隨機(jī)分為三組，MSC+HSC+Shh組Transwell培養(yǎng)板上室接種用IMDM培養(yǎng)基+500 ng/mL的Shh蛋白重懸的HSC，下室接種BMMSC；BMMSC+HSC組上室接種用IMDM培養(yǎng)基重懸后的HSC，下室接種BMMSC；HSC+Shh組上室接種用IMDM培養(yǎng)基+500 ng/mL的Shh蛋白重懸的HSC，下室加入培養(yǎng)基；對(duì)照組上室接種用IMDM培養(yǎng)基重懸的HSC，下室加入培養(yǎng)基。各組均培養(yǎng)72 h，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)HSC活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果培養(yǎng)72 h，HSC+BMMSC+Shh組HSC細(xì)胞計(jì)數(shù)較其他各組高(P均<0.05)，HSC+MSC組、HSC+Shh組較HSC組高(P均<0.05)，HSC+BMMSC組、HSC+Shh組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論BMMSC與外源性Shh蛋白可協(xié)同作用共同促進(jìn)HSC增殖。

骨髓造血干細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Shh蛋白；細(xì)胞增殖

骨髓造血干細(xì)胞(HSC)是一種多能干細(xì)胞，是一群最原始的并具有多向分化潛能的造血細(xì)胞，具有高度的自我復(fù)制潛能。HSC移植可重建受者造血和免疫功能，是治療各種良惡性血液病的有效手段。如何簡(jiǎn)便、快速分離及擴(kuò)增高純度的HSC是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)可分泌多種細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)HSC的歸巢和增殖，具有支持造血和免疫調(diào)節(jié)功能。Shh信號(hào)通路是在動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用的信號(hào)通路之一[1]。Shh在很多組織中調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[2～4]，外源性的Shh蛋白可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖[5]。2014年8月～2015年3月，本研究觀察BMMSC聯(lián)合外源性的Shh蛋白對(duì)HSC的調(diào)控作用，為HSC的體外擴(kuò)增提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 FBS購(gòu)自Hyclone公司，低糖DMEM購(gòu)自Invitrogen公司，胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，人抗鼠CD34-ECD、CD105-FITC、重組人干細(xì)胞因子(SCF)購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，CD45-PCy7購(gòu)自美國(guó)BD公司。IL-3購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，Shh蛋白購(gòu)自R&D system公司，Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman公司，微型磁珠分選儀(mini MACS)購(gòu)自Miltenyibiotec公司。

1.2 BMMSC分離、培養(yǎng)及鑒定 在無(wú)菌條件下抽取正常志愿者(22例，均為本院體檢健康者，男15例、女7例，年齡20～45歲)骨髓約6 mL，用全骨髓培養(yǎng)法，加入含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第8天，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳至第3代，將細(xì)胞用PBS洗2遍后，用0.25%胰蛋白酶消化第3代細(xì)胞，PBS沖洗后，分別用人抗鼠CD34-ECD、CD105-FITC、CD45-PCy7標(biāo)記。采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。

1.3 HSC分選及鑒定 無(wú)菌條件下抽取志愿者骨髓約12 mL。用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，采用磁珠分選法，按照mini MACS說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選，將分選的細(xì)胞用CD34+細(xì)胞試劑盒進(jìn)行表面抗原抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。

1.4 HSC增殖能力檢測(cè) 將分選成功的HSC隨機(jī)分為三組。BMMSC+HSC+Shh組：收集HSC用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基+500 ng/mL的Shh蛋白重懸制成細(xì)胞懸液，按照每孔100 μL的細(xì)胞懸液接種于Transwell培養(yǎng)板上室內(nèi)，HSC為1×105/孔；將含BMMSC培養(yǎng)液600 μL接種于Transwell培養(yǎng)板下室，BMMSC為1×106/孔。BMMSC+HSC組：收集HSC用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按照每孔100 μL的細(xì)胞懸液接種于Transwell培養(yǎng)板上室內(nèi)，HSC為1×105/孔；將含BMMSC培養(yǎng)液600 μL接種于Transwell培養(yǎng)板下室，BMMSC為1×106/孔。HSC+Shh組：將HSC接種于Transwell培養(yǎng)板上室，接種方法同BMMSC+HSC+Shh組，下室加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。對(duì)照組：上室僅添加IMDM培養(yǎng)基重懸的HSC，下室加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h，將Transwell上室加入IMDM培養(yǎng)基500 μL，用吸管反復(fù)輕輕吹打，將細(xì)胞移入試管，室溫下，離心(1 000 r/min)5 min，棄上清液。加入培養(yǎng)基500 μL重懸細(xì)胞，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)HSC活細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果 CD105+而CD34-、CD45-的細(xì)胞即為BMMSC，培養(yǎng)4 d，光鏡下可見(jiàn)少數(shù)梭形貼壁細(xì)胞，呈單個(gè)或成簇存在；培養(yǎng)7 d，細(xì)胞呈融合狀態(tài)；細(xì)胞比例為52.4%。CD34+細(xì)胞即為HSC，鏡下可見(jiàn)呈圓形，比例為81.9%。臺(tái)盼蘭拒染試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活率均大于95%。

2.2 各組HSC增殖能力比較 共培養(yǎng)72 h，HSC+MSC+Shh組、HSC+MSC組、HSC+Shh組、HSC組HSC細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(25.200±6.138)、(7.825±0.624)、(6.900±2.049)、(1.500±1.291)×105個(gè)。HSC細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，HSC+MSC+Shh組較其他各組高(P均<0.05)，HSC+MSC組、HSC+Shh組較HSC組高(P均<0.05)，HSC+MSC組、HSC+Shh組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

BMMSC作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的一種，是造血微環(huán)境中的重要組成部分。BMMSC不但對(duì)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)起支持作用，而且還分泌多種細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖與分化[6～8]。BMMSC可支持HSC的生長(zhǎng)[9,10]，促進(jìn)HSC的快速增殖，維持HSC池的擴(kuò)增和自我更新，保持HSC的多向分化潛能。BMMSC的這些作用可能與其分泌的細(xì)胞因子、表面的黏附分子受體和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)[11]。分泌的黏附分子受體和細(xì)胞外基質(zhì)分子能夠?yàn)镠SC的增殖提供基礎(chǔ)。并且BMMSC分泌的細(xì)胞因子參與調(diào)控HSC增殖、分化、凋亡、生長(zhǎng)抑制、趨化和隨意運(yùn)動(dòng)等。同時(shí)BMMSC可以分泌多種促進(jìn)HSC增殖又抑制其分化的細(xì)胞因子。BMMSC能夠分泌血管再生各種所需的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管生成素等。目前認(rèn)為，VEGF、血管生成素1(Ang-1)及Ang-2在毛細(xì)血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。BMMSC促進(jìn)HSC增殖可能還與其分泌的促血管生長(zhǎng)因子相關(guān)，促進(jìn)血管形成，為HSC的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有利于促進(jìn)其增殖。研究證實(shí)，不同的細(xì)胞作為滋養(yǎng)層模擬體內(nèi)造血微環(huán)境對(duì)促進(jìn)HSC增殖和修復(fù)的重要性[13]。基于BMMSC分泌的細(xì)胞因子可以促進(jìn)HSC的增殖[14]。本研究將HSC與BMMSC加入Transwell培養(yǎng)板中進(jìn)行共培養(yǎng)，72 h后HSC出現(xiàn)了增殖現(xiàn)象。其原因可能為在共培養(yǎng)過(guò)程中，下室的BMMSC分泌的多種細(xì)胞因子穿過(guò)Transwell培養(yǎng)板的微網(wǎng)進(jìn)入上室，從而促進(jìn)HSC增殖。但具體BMMSC分泌的哪些細(xì)胞因子促進(jìn)了HSC增殖，在后期研究中將對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。本文對(duì)研究骨髓造血微環(huán)境，特別對(duì)BMMSC促進(jìn)HSC體外擴(kuò)增的機(jī)制有了進(jìn)一步的闡釋，為研究HSC體外長(zhǎng)期擴(kuò)增以及培養(yǎng)提供基礎(chǔ)。

Hedgehog基因作為一種分節(jié)性極性基因，在哺乳動(dòng)物中有3個(gè)同源基因，包括編碼Shh蛋白的SHH基因、編碼Ihh蛋白的IHH基因和編碼Dhh蛋白的DHH基因[15]。用可溶性的Shh處理過(guò)的人HSC在小鼠體內(nèi)可生產(chǎn)大量的人造血細(xì)胞。表明，HSC對(duì)Hh信號(hào)起了應(yīng)答反應(yīng)，并進(jìn)行了自我更新。在穩(wěn)態(tài)下，激活Hh信號(hào)通路可以促進(jìn)原始血細(xì)胞的擴(kuò)增[16]。研究證明Hh信號(hào)可以抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的人HSC增殖，而加入可溶性的Shh蛋白可誘導(dǎo)HSC的增殖和擴(kuò)展[17]。加入外源性Shh蛋白內(nèi)可觸發(fā)成血-血管干細(xì)胞的增殖[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在體外加入外源性Shh蛋白可以促進(jìn)HSC/祖細(xì)胞(HSC/HPC)的增殖，其促HSC/HPC增殖的作用是通過(guò)BMP-4實(shí)現(xiàn)的[19]。本研究亦證實(shí)，外源性Shh蛋白可促進(jìn)HSC增殖。

Shh可以促進(jìn)BMMSC增殖分化，并可促進(jìn)HSC的增殖，BMMSC也可以促進(jìn)HSC增殖,但兩者在促進(jìn)HSC增殖方面是否存在協(xié)同作用是本研究的目的。外源性的Shh蛋白可促進(jìn)HSC增殖，而將外源性的Shh蛋白加入BMMSC與HSC共培養(yǎng)的Transwell中，之前很少有相關(guān)研究。本研究將外源性的Shh蛋白與BMMSC聯(lián)合，模擬造血微環(huán)境，觀察其對(duì)HSC的調(diào)控作用。研究證實(shí)，Shh聯(lián)合BMMSC促進(jìn)了HSC的增殖。說(shuō)明Shh蛋白與BMMSC之間存在相互協(xié)同作用，共同促進(jìn)HSC的增殖。猜測(cè)Shh蛋白在促進(jìn)HSC增殖的同時(shí)，也可能作用于BMMSC，促進(jìn)其某些促造血成分的分泌，導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)上調(diào)。外源性的Shh蛋白與BMMSC聯(lián)合共同促進(jìn)HSC增殖的機(jī)制將是繼續(xù)研究的方向。

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