謝玉燕,張莉,李凌佳,吳文娟,劉彤云(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,昆明650032)
Semaphorin 5A 在皮膚黑素瘤組織中的表達(dá)及與其惡性程度的相關(guān)性
謝玉燕,張莉,李凌佳,吳文娟,劉彤云
(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,昆明650032)
目的 觀察Semaphorin 5A在皮膚黑素瘤(CMM)組織中的表達(dá)情況,并探討其與CMM惡性程度的相關(guān)性。方法 選擇20例CMM患者和20例黑素細(xì)胞痣者的石蠟包埋組織標(biāo)本。CMM患者根據(jù)Clark(1969)分級方法,Ⅰ級3例(15.00%)、Ⅱ級3例(15.00%)、Ⅲ級4例(20.00%)、Ⅳ級7例(35.00%)、Ⅴ級有3例(15.00%) 。免疫組化法檢測Semaphorin 5A在CMM及黑素細(xì)胞痣皮損組織中的表達(dá),比較不同病理分級的CMM間Semaphorin 5A表達(dá)的差異。結(jié)果 Semaphorin 5A在CMM中的陽性表達(dá)率(80.00%,16/20)高于黑素細(xì)胞痣中的陽性表達(dá)率(5.00%,1/20)(P<0.05);且Semaphorin 5A在CMM中的表達(dá)與Clark分級呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Semaphorin 5A在CMM組織中的表達(dá)升高,與CMM惡性程度有關(guān)。
黑素瘤;Semaphorin 5A;免疫組織化學(xué)
皮膚黑素瘤(CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤,其源于黑素細(xì)胞,是由外胚層神經(jīng)嵴產(chǎn)生分化而來。Semaphorin 5A是神經(jīng)導(dǎo)向分子Semaphorins家族中的一員,該基因已經(jīng)被證實(shí)在胃癌組織中高表達(dá),Semaphorin 5A與plexin B3結(jié)合促進(jìn)胃癌的發(fā)展,并影響其侵襲和轉(zhuǎn)移。Woodhouse等[1]在人類黑色素瘤細(xì)胞A2058的膜提取物中檢測到Semaphorin 5A的表達(dá)。而該基因是否在CMM瘤組織中表達(dá)及其在瘤細(xì)胞中的作用尚未明確。本試驗(yàn)采用免疫組化法檢測Semaphorin 5A在CMM瘤組織及黑素細(xì)胞痣中的表達(dá),并初步分析Semaphorin 5A表達(dá)與CMM惡性程度之間的相關(guān)性。
1.1 臨床資料 收集2009~2015年昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科確診的20例CMM患者和20例黑素細(xì)胞痣者的石蠟包埋組織標(biāo)本。20例CMM患者中,男8例、女12例,男女比例2∶3。發(fā)病年齡32~73歲、平均年齡57.9歲,其中45歲以上者占85%。發(fā)生于面部2例(10.00%)、軀干1例(5.00%)、手臂1例(5.00%)、肢端16例(80.00%)。多數(shù)患者自述惡變前無明顯誘因,患者自述惡變前有明確外傷史3例(15.00%),曾外用刺激性藥物如雙氧水、雞眼膏者1例(5.00%)。皮損多為突出的黑色結(jié)節(jié)、腫塊或在黑色斑疹近期突然增大隆起,色素加深,出現(xiàn)糜爛甚至潰瘍,部分患者皮損周圍出現(xiàn)黑褐色斑疹呈衛(wèi)星樣分布。其中皮損表現(xiàn)為黑色斑片者5例,斑塊者3例,黑色結(jié)節(jié)者5例,潰瘍者7例。Clark(1969)病理分級方法參照文獻(xiàn)[2]:根據(jù)浸潤深度將CMM分為5級:Ⅰ級:瘤細(xì)胞限于基底膜以上的表皮內(nèi)(原位CMM);Ⅱ級:瘤細(xì)胞突破基底膜侵犯到真皮乳頭層;Ⅲ級:瘤細(xì)胞充滿真皮乳頭層,并進(jìn)一步向下侵犯,未到真皮網(wǎng)狀層;Ⅳ級:瘤細(xì)胞已侵犯到真皮網(wǎng)狀層;Ⅴ級:瘤細(xì)胞已穿過真皮網(wǎng)狀層,侵犯到皮下脂肪層。
1.2 組織中Semaphorin 5A蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,常規(guī)制片。將石蠟包埋組織標(biāo)本制成連續(xù)切片,厚度為4~6 μm,然后經(jīng)二甲苯脫蠟,抗原修復(fù),DAB顯色,全部過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,所用一抗為Semaphorin 5A蛋白多克隆抗體(1∶300)。Semaphorin 5A陽性對照圖片為試劑公司提供,并以PBS代替一抗作為陰性對照。
Semaphorin 5A陽性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜,呈棕黃或黃褐色顆粒。隨機(jī)選取陽性細(xì)胞密度高的區(qū)域5 個高倍視野(×400)計(jì)數(shù),通過對顏色的強(qiáng)弱及陽性細(xì)胞的個數(shù)進(jìn)行評分:沒有變色為0分,淺黃色1分,淺褐色2分,褐色3分;陽性細(xì)胞數(shù) <5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分。兩項(xiàng)評分相加,并分為4個等級,0~1分為-,2分為+,3~4分++,>5分+++,結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生采用雙盲原則判定。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示,比較采用χ2檢驗(yàn);Semaphorin 5A與CMM惡性程度等級相關(guān)性分析采用Kendall′ tau-c相關(guān)性分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 CMM組織病理學(xué)表現(xiàn)及Clark(1969)分級結(jié)果 20例CMM石蠟組織經(jīng)HE染色,顯微鏡下可見表皮及真皮分布異形的黑素瘤細(xì)胞,沿水平方向和(或)垂直方向生長,侵入真皮及皮下,細(xì)胞形態(tài)不一,大小不同,有核分裂相出現(xiàn),部分瘤細(xì)胞見明顯核仁,并可有色素顆粒沉積。根據(jù)Clark(1969)分級方法:Ⅰ級3例(15.00%),Ⅱ級3例(15.00%),Ⅲ級4例(20.00%),Ⅳ級7例(35.00%),Ⅴ級3例(15.00%) 。臨床表現(xiàn)為斑片者Clark分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級者3、1、1例,斑塊者Clark分級為Ⅱ、Ⅲ級者2、1例,結(jié)節(jié)者Clark分級為Ⅲ、Ⅳ級者1、4例,潰瘍者Clark分級為Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級者1、3、3例,經(jīng)過臨床及病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),臨床僅表現(xiàn)為黑斑的CMM多為Ⅰ級或 Ⅱ級,臨床為斑塊或黑色結(jié)節(jié)的CMM多為Ⅲ級及Ⅳ級,而出現(xiàn)潰瘍的CMM多為Ⅳ級及以上。
2.2 Semaphorin 5A在CMM及黑素細(xì)胞痣中的表達(dá)比較 Semmaphorin 5A陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜,呈棕黃色、褐色。20例CMM中,Semaphorin 5A蛋白表達(dá)+++者9例、++者7例、+者3例、陰性者1例,陽性率為80.00%(16/20)。20例黑素細(xì)胞痣中,Semaphorin 5A蛋白表達(dá)++者 1例、+者 4例、陰性者15例,陽性率5%(1/20)。兩者Semaphorin 5A蛋白表達(dá)陽性率比較,χ2=23.02,P<0.05。
2.3 Semaphorin 5A在CMM患者中的表達(dá)與腫瘤侵襲程度相關(guān)性 CMM Ⅰ級患者中Semaphorin 5A表達(dá)為-、+、++、+++者分別為1、2、0、0例,Ⅱ級者中分別為0、1、1、1例,Ⅲ級者中分別為0、0、1、3例,Ⅳ級者中分別為0、0、4、3例,Ⅴ級者中分別為0、0、1、2例,Semaphorin 5A在CMM瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的Clark分級呈正相關(guān)(r=0.6,P<0.05)。
CMM是由于黑素細(xì)胞過度增生引起的一種高度惡性的皮膚腫瘤,其源于黑素細(xì)胞,是由外胚層神經(jīng)嵴產(chǎn)生分化而來。CMM的發(fā)生與免疫、遺傳、創(chuàng)傷、環(huán)境因素有關(guān),好發(fā)于45歲以上中年人及中老年人,青少年發(fā)病者甚少,兒童罕見[3]。本研究結(jié)果也證實(shí),CMM好發(fā)于四肢末端,主要發(fā)病人群為45歲以上中老年患者,某些刺激或外傷可能造成黑素細(xì)胞痣的惡變,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。近年CMM發(fā)病率逐年增加。資料顯示,全世界CMM在近30年間增長了60%,我國每年約有新發(fā)病例2萬,其轉(zhuǎn)移速度快,預(yù)后差及病死率高,目前已成為惡性程度最高的皮膚腫瘤[3,4]。CMM淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早,腫瘤轉(zhuǎn)移患者的治療效果并不理想,5年生存率只有14%[5]。
CMM的病理表現(xiàn)為表皮及真皮分布異形的黑素瘤細(xì)胞,一般為梭形細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞等各種細(xì)胞形態(tài),侵入真皮及皮下,瘤細(xì)胞可見有核分裂相出現(xiàn),并可有色素顆粒沉積。Clark(1969)分級對CMM的病理浸潤深度進(jìn)行了分級,分級越高,預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示,臨床僅表現(xiàn)為黑斑的CMM多為Ⅰ級或Ⅱ級,臨床為斑塊或黑色結(jié)節(jié)的CMM多為Ⅲ級及Ⅳ級,而出現(xiàn)潰瘍的CMM多為Ⅲ級及以上。
Semaphorins是一個包含了30多個成員的神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子大家族,根據(jù)來源、種屬與結(jié)構(gòu)的異同,將Semaphorins分為8個亞家族[6]。其中Semaphorin 5是惟一既存在于脊椎動物(Semaphorin 5A和Semaphorin 5B)又存在于無脊椎動物(Semaphorin 5C)中的亞家族[7,8]。Semaphorins家族成員結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性,即在N-端含有一個高度保守的、富含半胱氨酸殘基的“sema”域,長為400~500個氨基酸[9]。而Semaphorin 5A作為該家族中的一員,其不光含有家族所共有的“Sema”域,并擁有一特征性結(jié)構(gòu)域“TSP-1”,即在胞膜外含有7個Ⅰ型血小板反應(yīng)素(TSP-1)重復(fù)序列, Semaphorin 5A中的“Sema”域和“TSP-1”與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[10]。
本試驗(yàn)采用免疫組化方法檢測了Semaphorin 5A在CMM瘤組織及黑素細(xì)胞痣中的表達(dá)情況,結(jié)果提示Semmaphorin 5A陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜,呈棕黃色、褐色。此結(jié)果支持Woodhouse等[1]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時本研究也發(fā)現(xiàn),Semaphorin 5A在CMM瘤組織中高表達(dá),在黑素細(xì)胞痣中不表達(dá)或弱表達(dá)。采用Kendall′ tau-c相關(guān)性分析亦發(fā)現(xiàn),Semaphorin 5A在CMM組織中的表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),即侵襲深度越深,其表達(dá)越強(qiáng)。以上結(jié)果提示,Semaphorin 5A可能為CMM惡性程度相關(guān)的潛在標(biāo)志物,并且可能具有促進(jìn)CMM侵襲轉(zhuǎn)移的能力,但其具體作用機(jī)制如何仍有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)的局限性在于樣本量較小,不排除存在誤差的可能。
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云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)(2013FB138)。
劉彤云(E-mail:tongyyun91@126.com)
10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.020
R774
B
1002-266X(2017)13-0065-03
2017-01-02)