高雁琳++李鈞敏++閆明

摘要：采用盆栽試驗(yàn)方法，以高丹草為研究對(duì)象，選用摩西球囊霉（Glomus mosseae）和地表球囊霉（Glomus versiforme），分別研究單接種和混合接種對(duì)粉煤灰（S1）、煤矸石（S2）和粉煤灰與煤矸石混合物（S3） 3種基質(zhì)上高丹草（Sorghum bicolor×S.sudanense）根系形態(tài)及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，并以正常沙土（S4）作為對(duì)照。結(jié)果表明：煤礦區(qū)廢棄物基質(zhì)上高丹草根系的生長(zhǎng)受到抑制，接種AM真菌減緩了高丹草根系生長(zhǎng)受抑制的程度，促進(jìn)根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根生物量的顯著增加；高丹草根系SOD、POD、CAT活性顯著提高，MDA含量降低。AM真菌可通過(guò)調(diào)節(jié)高丹草根系形態(tài)，提高根系抗氧化酶活性，增強(qiáng)高丹草在煤礦廢棄物復(fù)合逆境中的抗逆性，并且接種摩西球囊霉對(duì)粉煤灰以及[JP2]粉煤灰和煤矸石混合基質(zhì)上高丹草根系的促進(jìn)作用最佳，而接種地表球囊霉更適于煤矸石基質(zhì)上高丹草根系的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：叢枝菌根真菌（AMF）；煤礦廢棄物；高丹草；根系形態(tài)；抗氧化酶

中圖分類號(hào)： X171.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0452-05

收稿日期：2015-10-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30800133、31270461）；山西師范大學(xué)?；穑ň幪?hào)：ZR1211）。

作者簡(jiǎn)介：高雁琳 （1988—），女，山西朔州人，碩士，主要從事菌根生態(tài)學(xué)研究。E-mail：cgsayll@126.com。

通信作者：閆明，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植被生態(tài)學(xué)研究。E-mail：mycorrhiiza@sina.com。

煤礦開(kāi)采對(duì)環(huán)境造成極大擾動(dòng)，引發(fā)了一系列亟待解決的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，如水土流失、土地貧瘠化、鹽堿化等。采煤沉陷區(qū)是煤礦廢棄地復(fù)墾的主要類型之一，其治理也是目前礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的重大難題。充填復(fù)墾是采煤沉陷區(qū)植被重建的主要方式之一，而煤矸石和粉煤灰是目前充填復(fù)墾的主要材料[1]，然而，其具有物理結(jié)構(gòu)不良、保水保肥能力差、營(yíng)養(yǎng)元素缺乏、重金屬濃度高、鹽分含量過(guò)高、極端pH值以及微生物區(qū)系稀少且活性極低等許多不利因子[2]，可引起植物生長(zhǎng)及其生理活性的降低，最終導(dǎo)致植被退化，因此，增強(qiáng)煤礦廢棄地植被抗逆性、提高植物成活率具有實(shí)際意義。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）存在于幾乎所有類型的土壤中，可以與陸地上絕大部分的高等植物物種形成互惠共生體[3]，改善植物對(duì)水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，增強(qiáng)植物對(duì)高鹽度及重金屬等不利因子的耐性[4-5]，提高植物存活率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

目前，煤礦區(qū)AM真菌的研究，一方面集中在對(duì)煤礦區(qū)AM真菌的調(diào)查、分類以及優(yōu)勢(shì)AM真菌的篩選[6-7]，另一方面集中在通過(guò)接種AM真菌對(duì)煤礦區(qū)土壤進(jìn)行改良（如土壤肥力、土壤酶活性[8-9]等）以及對(duì)植物進(jìn)行修復(fù)（如促進(jìn)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收[10-11]和對(duì)重金屬的吸收與轉(zhuǎn)移[12]等方面）。植物根系是吸收水分和養(yǎng)分并進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要器官，其生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)特征直接影響地上部的形態(tài)建成和物質(zhì)積累，同時(shí)也是AM真菌侵染和最先感受煤礦廢棄物不利因子復(fù)合脅迫信號(hào)的部位[13]。AM真菌如何影響煤礦廢棄物在復(fù)合逆境中植物根系的形態(tài)及抗氧化酶系統(tǒng)，能否促進(jìn)根系的生長(zhǎng)、提高抗氧化酶的活性、增強(qiáng)植物的抗逆性，目前相關(guān)研究較少。因此，本研究以高丹草為試驗(yàn)材料，分析了單接種和混合接種AM真菌對(duì)不同類型煤礦區(qū)廢棄物上高丹草根系形態(tài)、根系活力和抗氧化酶活性的影響，并進(jìn)一步篩選出不同類型的煤礦廢棄物上高丹草接種的最適AM菌種，以期為運(yùn)用菌根技術(shù)提高煤礦區(qū)植被恢復(fù)效果提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菌種摩西球囊霉（Glomus mosseae，BGC NM01A）和地表球囊霉（Glomus versiforme，BGC GD01C），由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物與營(yíng)養(yǎng)資源研究所提供，接種劑為以高粱為宿主植物繁殖的土沙混合物，內(nèi)含被感染根段、孢子和菌絲。高丹草[Sorghum bicolor （L.） Moench×Sorghum sudanense（Piper） Stapf，晉草1號(hào)] 種子由山西省臨汾市小麥研究所提供。供試基質(zhì)為煤矸石（取自山西省臨汾市煤運(yùn)公司煤炭轉(zhuǎn)運(yùn)站）、粉煤灰（取自山西省漳澤電力臨汾熱電公司）及土沙混合物（黃土和河沙體積比為3 ∶[KG-*3]1）。煤矸石過(guò)3 mm篩，黃土、河沙和粉煤灰過(guò)1 mm篩，經(jīng)121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌2 h，取出放置1周后備用。栽培容器為棕色圓形塑料花盆（盆口直徑18 cm×盆底直徑14 cm×盆高15 cm）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)定2個(gè)因素：菌根和基質(zhì)。菌根有4個(gè)水平：不接種對(duì)照（CK）、接種G.mosseae（G.m）、接種G.versiforme（G.v） 以及兩者混合接種（G.mv）；基質(zhì)有4個(gè)水平：粉煤灰、煤矸石、粉煤灰與煤矸石混合物（體積比為1 ∶[KG-*3]4） 以及沙土混合物（體積比為1 ∶[KG-*3]3） ，依次編號(hào)S1、S2、S3、S4，供試基質(zhì)基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，共計(jì)64盆。2014年6月2日挑選籽粒飽滿、大小均一的種子，置于10% H2O2 中表面消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次，置于 25 ℃ 培養(yǎng)箱中的濕潤(rùn)紗布上催芽，種子露白即可播種。每盆裝厚度約8 cm的滅菌基質(zhì)，粉煤灰、煤矸石、粉煤灰與煤矸石混合物及沙土混合物的質(zhì)量分別為1 405、1 785、1 598、2 250 g，其上覆蓋滅菌沙土800 g，厚度約為3 cm，采用菌種層接法，分別稱取接種劑G.m、G.v以及2種菌劑按1 ∶[KG-*3]1比例混合均勻后的接種劑各120 g，將60 g菌劑均勻撒施在土壤表面，放入已催芽的種子20粒，在其上覆蓋60 g菌劑，再覆蓋沙土220 g，厚度約為1 cm。不接種處理采用相同方法加入120 g的滅菌菌劑。

1.3測(cè)定參數(shù)和方法

2014年8月31日收苗，將整個(gè)植株連同花盆一起浸泡在水中，將植株從花盆中小心取出，洗凈后，用WinRHIZO根系分析儀測(cè)定根表面積、根體積和根平均直徑；用Phillips and Hayamn [14]方法進(jìn)行染色，統(tǒng)計(jì)菌根侵染率；將收獲的植株根系置于烘箱中，105 ℃烘干至恒重稱質(zhì)量，計(jì)算生物量。

采用TTC法測(cè)定根系活力；采用NBT法測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性；采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[15]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差的計(jì)算，并進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1接種AM真菌對(duì)高丹草根系菌根侵染率的影響

由圖1可知，4種基質(zhì)上3種接種處理均獲得較高的菌根侵染率，且均存在顯著性差異，未接種處理菌根侵染率極低。在基質(zhì)S1、S3和S4上接種G.m處理菌根侵染率均為最高（P<0.05），分別為65.41%、68.59%、58.00%，接種G.v處理菌根侵染率均較低，分別為35.36%、39.44%、42.39%；而在S2基質(zhì)上接種G.mv處理菌根侵染率顯著高于其他2種接種處理，為67.14%，接種G.m和G.v處理間菌根侵染率差異不顯著。接種G.m處理基質(zhì)S1和S3間菌根侵染率差異不顯著，基質(zhì)S2和S4間無(wú)顯著差異。接種G.v和G.mv處理基質(zhì)S2上菌根侵染率顯著高于其他基質(zhì)，未接種處理4種基質(zhì)間菌根侵染率無(wú)顯著差異。

[FK（W13][TPGYL1.tif]

2.2[JP3]接種AM真菌對(duì)高丹草根系形態(tài)、生物量和根系活力的影響

4種基質(zhì)上接種AM真菌顯著增加了植物根系活力、根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根生物量，顯著降低根平均直徑（圖2，P<0.05）。在基質(zhì)S1上，3種接種處理間根體積差異不顯著，接種G.v和G.mv處理間根長(zhǎng)、根表面積、根生物量差異不顯著，顯著低于接種G.m處理。在基質(zhì)S2上，接種G.v和G.mv處理間根長(zhǎng)差異不顯著，接種G.v處理根表面積、根體積和根生物量顯著高于其他接種處理。在基質(zhì)S3和S4上，接種G.m處理根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根生物量均顯著高于其他接種處理；基質(zhì)S4上接種G.v和G.mv處理間根長(zhǎng)和根體積差異不顯著?；|(zhì)S1、S3和S4上接種G.v和G.mv處理間根平均直徑差異不顯著，但顯著高于接種G.m處理；基質(zhì)S2上3種接種處理間根平均直徑無(wú)顯著差異。在基質(zhì)S1和S4上，接種G.m處理根系活力顯著高于其他接種處理；在基質(zhì)S2上，3種接種處理間根系活力差異不顯著；在基質(zhì)S3上[CM（25]接種G.m和G.mv處理間根系活力差異不顯著，顯著高于[CM）]

[FK（W30][TPGYL2.tif]

接種G.v處理?；|(zhì)S4根平均直徑顯著高于其他3種基質(zhì)，3種礦區(qū)廢棄物基質(zhì)中基質(zhì)S3上高丹草其他各指標(biāo)均高于基質(zhì)S1和S2。

2.3接種AM真菌對(duì)高丹草根系抗氧化酶和MDA含量的影響

從圖3可以看出，與未接種處理相比，接種AM真菌顯著提高了SOD、POD、CAT活性，降低了MDA含量?；|(zhì)S1、S2和S4上，接種G.v和G.mv處理間SOD、CAT活性差異不顯著；基質(zhì)S1和S4上，兩者均顯著低于接種G.m處理；在基質(zhì)S2上兩者均顯著高于接種G.m處理?；|(zhì)S1和S3上接種G.m處理POD活性顯著高于其他接種處理，接種G.v處理顯著低于其他接種處理（P<0.05）；在基質(zhì)S2和S4上，接種G.v 和G.mv處理間POD活性差異不顯著?；|(zhì)S1上，接種G.m處理MDA含量顯著低于其他接種處理；在基質(zhì)S2上，3種接種處理間MDA含量差異不顯著；在基質(zhì)S3和S4上接種G.v和G.mv處理間MDA含量差異不顯著，顯著高于接種G.m 處理。3種礦區(qū)廢棄物基質(zhì)上高丹草SOD、POD、CAT活性以及MDA含量顯著高于基質(zhì)S4?；|(zhì)S3上高丹草根系SOD、POD、CAT活性顯著高于其他2種煤礦廢棄物基質(zhì)，MDA含量顯著低于其他2種煤礦廢棄物基質(zhì)。

2.4高丹草根系抗氧化酶活性MDA含量與其他各指標(biāo)相關(guān)性分析

由表2可知，菌根侵染率與根系活力、CAT活性呈極顯著正相關(guān)，與根平均直徑和MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與根體積、根生物量呈顯著正相關(guān)，與根表面積、根長(zhǎng)、SOD活性和POD活性呈正相關(guān)，但未達(dá)顯著水平；SOD活性和POD活性與根平均直徑均呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他根系參數(shù)呈正相關(guān)，未達(dá)顯著水平；CAT活性與根系活力、根表面積和根體積呈顯著正相關(guān)，與根長(zhǎng)和根生物量呈正相關(guān)，未達(dá)顯著水平；MDA含量與根平均直徑呈正相關(guān)，未達(dá)顯著水平，與其他各參數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3討論

本試驗(yàn)中，4種基質(zhì)上3種接種處理均具有較高的菌根侵染率，表明AM真菌與高丹草建立了良好的共生關(guān)系。4種基質(zhì)不同，菌根侵染率以及菌種間的相互作用有差異，這種差異可能是因?yàn)?種基質(zhì)的pH值、營(yíng)養(yǎng)成分和有機(jī)質(zhì)含量以及基質(zhì)類型等理化性質(zhì)存在顯著差異（表1），菌根侵染率及菌種間的相互作用受到基質(zhì)類型、pH值、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和有機(jī)質(zhì)含量等理化性質(zhì)以及宿主植物等因素的綜合影響。菌根與基質(zhì)以及宿主植物之間存在一定的選擇性，不同菌種對(duì)不同基[CM（25]質(zhì)的適應(yīng)和生存能力以及宿主植物的親和力不同，從而造在土壤逆境脅迫條件下，植物最先感受逆境脅迫的器官是根系。重金屬、鹽堿以及養(yǎng)分缺乏等脅迫條件均會(huì)抑制植物根系生長(zhǎng)[17-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，煤礦廢棄物基質(zhì)上高丹草根系生長(zhǎng)受到抑制，接種AM真菌顯著增加了根長(zhǎng)、根表面積、根體積，提高了根系活力，從而影響根系生物量，這與張中鋒等研究結(jié)果[18]以及相關(guān)性分析結(jié)果一致。表明在煤礦廢棄物復(fù)合逆境中AM真菌可能通過(guò)一定的途徑調(diào)整高丹草根系代謝途徑和方向，改變碳同化產(chǎn)物的分配比例和方向，進(jìn)而改變根系形態(tài)和分布，增加了高丹草根系與土壤的接觸面積，促進(jìn)了高丹草根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收以及碳水化合物向根系的積累和分配，從而維持其功能行為，提高了高丹草對(duì)煤礦廢棄物復(fù)合逆境脅迫的抗性。此外，AMF可誘導(dǎo)高丹草根系產(chǎn)生更多生長(zhǎng)素，且AMF孢子自身含有的微量生長(zhǎng)素也可轉(zhuǎn)移到高丹草根系中，促進(jìn)根系生長(zhǎng)發(fā)育。在煤礦廢棄物復(fù)合逆境中接種AM真菌高丹草根平均直徑顯著降低，相關(guān)性分析表明菌根侵染率與根平均直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明AM真菌可能誘導(dǎo)高丹草根系更細(xì)小，使其易從煤礦廢棄物中吸收更多的水分和養(yǎng)分。一般認(rèn)為，AM真菌對(duì)宿主植物侵染率越高，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)的可能性也就越大[20]。本試驗(yàn)中基質(zhì)S1、S3和S4均符合這一規(guī)律，這與趙仁鑫等的研究結(jié)果[2，21]一致；然而在基質(zhì)S2上，混合接種處理對(duì)高丹草的侵染率較其他接種處理高，但對(duì)高丹草根系生長(zhǎng)的促進(jìn)效果反而低于接種G.v處理，這與Bi等的研究結(jié)果[22]相似。這表明菌根對(duì)宿主植物的作用不完全由侵染率決定，可能與由于煤礦廢棄物基質(zhì)類型、條件以及菌種的適應(yīng)性不同，造成菌根共生關(guān)系中成本-收益不平衡有關(guān)。4種基質(zhì)上高丹草根系生長(zhǎng)表現(xiàn)為S4>S3>S2>S1，這與王輝等的研究結(jié)果[23]相似，說(shuō)明與粉煤灰相比，高丹草更適合在煤矸石上生長(zhǎng)，粉煤灰和煤矸石按一定比例混合可對(duì)粉煤灰和煤矸石的理化性質(zhì)起到一定的改良作用。

研究表明，正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，逆境脅迫下（如重金屬、鹽堿以及養(yǎng)分缺乏等）該平衡受到破壞，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧、自由基大量積累，引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用，細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累，對(duì)植物造成嚴(yán)重傷害[19]。本試驗(yàn)中，3種煤礦廢棄物基質(zhì)上高丹草根系中MDA含量顯著高于正?；|(zhì)，接種AM真菌顯著降低了根系中MDA含量，這與謝翔宇等的研究結(jié)果[19，24]一致。表明煤礦廢棄物復(fù)合逆境中高丹草根系活性氧含量增加，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度加劇，接種AMF可減緩該逆境下高丹草根系中膜脂過(guò)氧化程度，減輕細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷。在逆境脅迫下，SOD、POD和CAT是植物的重要保護(hù)酶類。植物體內(nèi)存在一個(gè)由SOD、POD和CAT等組成的活性氧自由基清除系統(tǒng)，正常環(huán)境下，SOD、POD、CAT及其他保護(hù)物質(zhì)能夠維持植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而降低ROS對(duì)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成傷害的可能性[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種煤礦廢棄物基質(zhì)上高丹草根系SOD、POD、CAT活性均高于正常基質(zhì)，說(shuō)明高丹草根系感受到煤礦廢棄物基質(zhì)不利因子的脅迫信號(hào)時(shí)，由于自身的應(yīng)激能力，可通過(guò)提高根系抗氧化酶活性來(lái)適應(yīng)煤礦廢棄物的不良環(huán)境，郭紹霞等也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果[25]。接種AM真菌顯著提高了煤礦廢棄物上高丹草根系中SOD、POD和CAT的活性，相關(guān)性分析結(jié)果證明了這一點(diǎn)。說(shuō)明在煤礦廢棄物復(fù)合逆境中接種AMF可能促進(jìn)了3種酶在mRNA水平上的表達(dá)[26]，增加了高丹草根系抗氧化酶活性，增強(qiáng)了根系中自由基的清除能力，降低了MDA含量，從而減輕了煤礦廢棄物不利因子對(duì)高丹草造成的膜傷害，增強(qiáng)其抗逆性。相關(guān)性分析顯示，高丹草根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根生物量與根系抗氧化酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，與MDA含量呈負(fù)相關(guān)，表明AM真菌可通過(guò)改善高丹草根系酶促反應(yīng)系統(tǒng)，提高根系抗氧化酶活性，降低膜脂過(guò)氧化程度，來(lái)緩解煤礦廢棄物不利因子對(duì)高丹草根系的復(fù)合脅迫，影響其根系生長(zhǎng)發(fā)育，提高其對(duì)該復(fù)合逆境的抗逆性。

4 結(jié)論

3種煤礦廢棄物基質(zhì)上，高丹草根系生長(zhǎng)受到抑制，根系形態(tài)指標(biāo)和生物量顯著降低，MDA含量增加，由于高丹草自身對(duì)煤礦廢棄物基質(zhì)不利因子的應(yīng)激能力，根系抗氧化酶活性顯著增加。AM真菌很好地侵染了高丹草根系，接種AM真菌顯著提高了高丹草的根系活力，增加了根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根生物量，誘導(dǎo)高丹草根系保護(hù)酶（SOD、POD和CAT）活性提高，降低了膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，從而緩解了煤礦廢棄物基質(zhì)的不利因子對(duì)根系造成的損傷，維持高丹草的正常生長(zhǎng)，提高其在煤礦廢棄物復(fù)合逆境中的抗逆性，并且接種G.m對(duì)粉煤灰以及粉煤灰和煤矸石混合基質(zhì)上高丹草根系的促進(jìn)作用最佳，而接種G.v更適于煤矸石基質(zhì)上高丹草根系的生長(zhǎng)。因此，在煤礦區(qū)廢棄地生態(tài)恢復(fù)中，為更好地發(fā)揮菌根的作用，應(yīng)針對(duì)不同類型煤礦廢棄地接種不同的AM真菌，在一定程度上可解決礦區(qū)廢棄地植被生長(zhǎng)受脅迫和易退化等問(wèn)題，提高植被恢復(fù)效果。

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