沈鳳，丁妍，譚玉潔, 3

(1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院；3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

TET1基因敲除的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲能力觀察

沈鳳1，丁妍2，譚玉潔1, 3

(1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院；3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察TET1基因敲除的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲能力。方法 采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TET1敲除的Hela細(xì)胞株(觀察組)，同時(shí)選擇野生Hela細(xì)胞作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)觀察兩組細(xì)胞增殖能力，計(jì)算兩組90 h時(shí)的細(xì)胞指數(shù)(CI)值；采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 觀察組、對(duì)照組CI值分別為1.04±0.86、1.57±1.01，兩組相比P<0.05。觀察組、對(duì)照組24 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(158±6)、(109±4)個(gè)，48 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(206±12)、(142±7)個(gè)，兩組相比P均<0.05。結(jié)論 TET1基因敲除的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力、侵襲能力增強(qiáng)。

宮頸癌；Hela細(xì)胞；TET1基因；CRISPR/Cas9技術(shù)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

DNA胞嘧啶甲基化是一個(gè)可逆性的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物，參與了細(xì)胞生理的關(guān)鍵過(guò)程，包括X染色體失活、印記和轉(zhuǎn)錄特異基因等[1]。TET蛋白家族在DNA胞嘧啶的去甲基化、胚胎發(fā)育和基因重新編碼等過(guò)程存在重要作用，且與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2,3]，成員有TET1、TET2和TET3。TET1發(fā)現(xiàn)最早，是一種羥基化酶，能啟動(dòng)DNA去甲基化程序，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的發(fā)育，并與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等疾病發(fā)病密切相關(guān)[4]。TET1在宮頸癌中的研究較少，因此本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)[5,6]構(gòu)建了穩(wěn)定敲除TET1的宮頸癌Hela細(xì)胞，并觀察其細(xì)胞增殖、侵襲能力變化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器及試劑 Hela細(xì)胞和DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，pGK1.2質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司?；蚪M提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠純化/回收試劑盒、Taq PCR Mastermix、Matrige膠購(gòu)自TIANGEN(天根)公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，T4DNA連接酶和T7E1酶購(gòu)自NEB(北京)有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DNA Marker購(gòu)自碧云天公司，瓊脂糖購(gòu)自上海博亞公司。

1.2 TET1基因敲除的宮頸癌Hela細(xì)胞獲取方法

1.2.1 oligo DNA設(shè)計(jì)和合成 通過(guò)CRISPR Design在線工具在靶標(biāo)DNA區(qū)域中設(shè)計(jì)oligo DNA序列，為使pGK載體形成黏性末端，引物合成需在靶序列頭部添加額外的堿基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC。分別設(shè)計(jì)3組oligo DNA，在位點(diǎn)上下游各設(shè)計(jì)1條引物，用于后續(xù)檢測(cè)。TET1(Cas9)-1 F:5′-CACCGAGGCTTCTGACTGGCACGGG-3′,R：5′-AAACCCCGTGCCAGTCAGAAGCCTC-3′;TET1(Cas9)-2 F:5′-CACCGATCTGGAAGGCCTTGCATGG-3′,R：5′-AAACCCATGCAAGGCCTTCCAGATC-3′;TET1(Cas9)-3 F:5′-CACCGCCTTGGTTGTCTTTCGTAGT-3′,R：5′-AAACACTACGAAAGACAACCAAGGC-3′；T7E1 F:5′-GACCAAAACCTTGTGTGA-3′,R：5′-TGCTTCGTAGCGCCATTGTA-3′。

1.2.2 載體構(gòu)建 將上述合成的2條單鏈oligo DNA退火形成雙鏈的dsDNA，再將dsDNA連接到pGK1.2質(zhì)粒，最后篩選陽(yáng)性質(zhì)粒。dsDNA形成體系：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，降溫至25 ℃。連接反應(yīng)體系：pGK1.2質(zhì)粒150 ng，gRNA寡核苷酸雙鏈1 μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，補(bǔ)足雙蒸水至10 μL，充分混勻后在PCR儀上4 ℃連接過(guò)夜。將連接過(guò)夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中，然后挑取單克隆細(xì)菌到含有卡那霉素(pGK1.2為Kan抗性)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，選擇能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)帶目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒。進(jìn)行菌落PCR和2%瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，只有TET1(cas9)-2在100 bp處有條帶，將其菌液送到生工測(cè)序，并將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因組DNA提取 將上述Case9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，成功后提取基因組DNA進(jìn)行后續(xù)PCR及T7E1檢測(cè)。Hela細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清在37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)6孔板中的Hela細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 Reagent將Case9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，質(zhì)粒終濃度為1.5 μg/L，同時(shí)采用空白質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染操作均按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染成功的Hela細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光，可采用熒光顯微鏡觀察。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞培養(yǎng)72 h，取一部分細(xì)胞進(jìn)行傳代以及凍存保種，另一部分細(xì)胞消化后用PBS洗3次，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取基因組DNA。

1.2.4 TET1-gRNA的敲除效率檢測(cè) 采用PCR、T7E1酶切法。PCR條件如下：Taq PCR Mastermix 5 μL，TET1(T7E1)-(F+R)0.5 μL，基因組DNA 2 μL，補(bǔ)水至10 μL。程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。先取上述反應(yīng)后的產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到目的條帶后進(jìn)行T7E1檢測(cè)。T7E1分析步驟如下：PCR產(chǎn)物5 μL，10×T7E1 Buffer 1 μL，補(bǔ)水至10 μL；使用PCR儀進(jìn)行加熱變性，退火處理95 ℃ 5 min，自然冷卻至室溫；將上述反應(yīng)體系分別加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃反應(yīng)30 min后用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。選取兩孔轉(zhuǎn)染TET1-gRNA質(zhì)粒成功的Hela細(xì)胞(觀察組)及野生型Hela細(xì)胞(對(duì)照組)，正常培養(yǎng)72 h后提取基因組DNA，T7E1酶切驗(yàn)證結(jié)果顯示觀察組細(xì)胞在約300、100 kb處均有敲除后的特異性條帶，采用凝膠定量軟件計(jì)算切割效率[7]，切割效率分別為54%和30%，對(duì)照組細(xì)胞只有500 kb條帶。

1.2.5 細(xì)胞TET1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。將上述兩組Hela細(xì)胞接種至96孔板培養(yǎng)，每孔單細(xì)胞接種，等細(xì)胞長(zhǎng)到一定數(shù)量后擴(kuò)增至24孔板，再等細(xì)胞長(zhǎng)到一定數(shù)量后，擴(kuò)增至12孔板，此時(shí)將細(xì)胞部分保種凍存，部分提取細(xì)胞蛋白，同時(shí)提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的片段，送生工測(cè)序。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞正常表達(dá)TET1蛋白，觀察組蛋白表達(dá)明顯下調(diào)或缺失。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)。常規(guī)培養(yǎng)觀察組、對(duì)照組Hela細(xì)胞，待其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)。采用25%的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓變透亮?xí)r，棄掉胰酶加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞，接種于無(wú)菌的E-plate細(xì)胞板，每孔設(shè)8個(gè)復(fù)孔。按照儀器使用說(shuō)明書(shū)，在xCELLigence RTCA S16系統(tǒng)上培養(yǎng)90 h，自動(dòng)實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞增殖情況并繪制曲線。計(jì)算兩組90 h的細(xì)胞指數(shù)(CI)，CI值與細(xì)胞數(shù)量成正比，細(xì)胞量越多，CI值越高，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)[8]。

1.4 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)Transwell小室加入稀釋后的Matrigel膠200 μL，置于培養(yǎng)箱中4 h后使用。在Transwell上室中加入200 μL無(wú)血清的DMEM，下室中加入500 μL含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液DMEM。將觀察組、對(duì)照組Hela細(xì)胞分別計(jì)數(shù)3 000個(gè)細(xì)胞加入到上室中培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48 h后結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)算穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量，每張膜隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 觀察組、對(duì)照組CI值分別為1.04±0.86、1.57±1.01，兩組相比P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組、對(duì)照組24 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(158±6)、(109±4)個(gè)，48 h穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(206±12)、(142±7)個(gè)，兩組相比P均<0.05。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病與HPV感染有關(guān)，但HPV感染并不是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的惟一因素，DNA甲基化也參與宮頸癌的發(fā)生及演進(jìn)[9]。TET1是體內(nèi)一種高效催化DNA胞嘧啶的加氧酶，具有明顯的去甲基化作用。TET1在DNA去甲基過(guò)程、干細(xì)胞編程和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等方面起關(guān)鍵作用，它發(fā)揮作用的主要方式是通過(guò)將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶達(dá)到DNA去甲基化目的。這幾種物質(zhì)之間存在著甲基化和去甲基化的動(dòng)態(tài)平衡，如果TET1的表達(dá)缺失，這種平衡將被打破，就可能引起癌癥的發(fā)生或發(fā)展。研究[10]發(fā)現(xiàn)，TET1在多種腫瘤如肝細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、膀胱癌中呈低表達(dá)。且TET1的減少或者缺失和癌癥的發(fā)生和進(jìn)展關(guān)系密切，如乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌等[11]。

本研究細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組CI比對(duì)照組高，表明觀察組增殖能力增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組24、48 h的穿膜細(xì)胞數(shù)均比對(duì)照組多，表明觀察組的侵襲能力增強(qiáng)?？梢?jiàn)，降低TET1基因的表達(dá)水平，Hela細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)。Cimmino等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TET1在造血系統(tǒng)中調(diào)節(jié)多種生理或病理過(guò)程，可能起抑癌基因作用。研究[13,14]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌、前列腺癌與乳腺癌組織中TET1基因表達(dá)下調(diào)。ONeri等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TET1缺失促進(jìn)了結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)，還誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；TET1過(guò)表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞的侵襲并抑制了其他部位轉(zhuǎn)移瘤的形成。結(jié)合本研究結(jié)果推斷TET1低表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

可見(jiàn)，TET1表達(dá)的下調(diào)不僅與宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且可能是活化基因、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素之一。對(duì)TET1的深入研究將有助于弄清腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及治療有重要幫助。

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Proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cervical cancer cells

SHENFeng1,DINGYan,TANYujie

(1GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China)

Objective To observe the proliferation and invasion abilities of ten-eleven translocation 1 (TET1) gene knock-out Hela cervical cancer cells. Methods We constructed the TET1 knock-out Hela cells by CRISPR/Cas9 technology, which were defined as the observation group. At the same time, we defined wild Hela cells as the control group. We observed the proliferation ability of Hela cells in the observation and control group by the real-time cellular analysis (RTCA), and calculated the cell index (CI) values in each group at 90 h. We observed the invasion ability of Hela cells in each group by Transwell assay. Results The CI value of the observation group was 1.04±0.86, which was higher than that of the control group (1.47±1.01) (P<0.05). At 24 h, the transmembrane cells in the observation group and the control group were 158±6 and 109±4, respectively; at 48 h, the of transmembrane cells in each group were 206±12 and 142±7, respectively; significant difference was found between these two groups (P<0.05). Conclusion The proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cells become stronger.

cervical carcinoma; Hela cells; TET1 gene; CRISPR/Cas9 technique; cell proliferation; cell invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81602297)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合基礎(chǔ)2016-1121)。

沈鳳(1986-)，女，碩士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事宮頸癌及宮頸相關(guān)疾病的研究。E-mail: 449241354@qq.com

譚玉潔(1969-)，女，碩士，主任技師，主要從事宮頸癌及宮頸相關(guān)疾病的研究。E-mail: 943356809@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.007

R737.33

A

1002-266X(2017)22-0023-03

2016-12-05)