陳林建，李朝暉，藍(lán)國波

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬佛山禪城醫(yī)院，廣東佛山528031)

過表達(dá)miR-200c對人髓核細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

陳林建，李朝暉，藍(lán)國波

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬佛山禪城醫(yī)院，廣東佛山528031)

目的 觀察過表達(dá)miR-200c對人髓核細(xì)胞(HNPCs)凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HNPCs，將HNPCs分為觀察組、陰性組和空白組，觀察組轉(zhuǎn)染hsa-miR-200c mimics，陰性組轉(zhuǎn)染陰性對照mimics-NC，空白組未經(jīng)任何干預(yù)。轉(zhuǎn)染后24 h，采用real-time PCR法檢測3組細(xì)胞miR-200c的表達(dá)，流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率，ELISA平板計數(shù)法檢測Caspase3/7活性，Western blotting法檢測3組細(xì)胞酪氨酸蛋白激酶受體B(TrkB)蛋白。結(jié)果 觀察組、陰性組和空白組細(xì)胞miR-200c相對表達(dá)量分別為8.11±0.21、1.07±0.04、0.99±0.05，細(xì)胞凋亡率分別為23.6%±3.1%、1.5%±0.2%、1.6%±0.1%,Caspase3/7活性分別為299.237±24.245、119.476±10.657、117.317±11.317,TrkB蛋白相對表達(dá)量分別為0.48±0.11、0.50±0.12、0.15±0.06,觀察組與陰性組、空白組比較，P均<0.01。結(jié)論 過表達(dá)miR-200c能夠促進(jìn)HNPCs的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控TrkB的表達(dá)有關(guān)。

微小RNA-200c；人髓核細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；酪氨酸蛋白激酶受體B蛋白

椎間盤退變是脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)，患病率呈逐年上升趨勢[1]。目前椎間盤退變的具體機(jī)制尚不明確，年齡、生物力學(xué)、機(jī)械因素、炎性因子、基因等多種因素可能參與了此病理過程。基因因素在椎間盤退變中的作用近年來受到學(xué)者的廣泛關(guān)注[2～4]。髓核細(xì)胞的凋亡是椎間盤退變發(fā)生的重要機(jī)制[5]，導(dǎo)致的髓核細(xì)胞數(shù)量減少是椎間盤退變主要形態(tài)學(xué)改變之一[6]，但目前引起髓核細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不完全明確。微小RNA(miRNA)是一類存在于生物體中可以調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非

編碼小分子RNA，通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯對靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。miRNA芯片檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，退變椎間盤組織中存在著大量異常表達(dá)的miRNA[8,9]，影響髓核細(xì)胞的增殖及凋亡，與椎間盤退變密切相關(guān)[10,11]。miR-200c是miR-200家族成員之一，在嚴(yán)重腰椎間盤退變患者腰椎間盤組織中表達(dá)明顯增高[9]。miR-200c在多種細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用[12～14]，但是否影響髓核細(xì)胞的凋亡尚不明確。2015年10月～2016年7月，本研究在體外建立高表達(dá)miR-200c的人髓核細(xì)胞(HNPCs)，模擬椎間盤退變患者椎間盤組織中miR-200c的高表達(dá)狀態(tài)，觀察過表達(dá)miR-200c對HNPCs凋亡的影響，以探討miR-200c在椎間盤退變中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 HNPCs購自Scien Cell公司。hsa-miR-200c mimics及陰性對照mimics-NC均購自廣州銳博生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；miR-200c及U6引物由上海吉凱基因公司設(shè)計合成；TRIzol試劑和Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司；Apo-ONE Homogeneous Caspase3/7檢測試劑盒購自Promega公司；鼠抗人酪氨酸蛋白激酶受體B(TrkB)、GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HNPCs分為觀察組、陰性組和空白組。將3組HNPCs培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代，待細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。觀察組轉(zhuǎn)染hsa-miR-200c mimics，陰性組轉(zhuǎn)染mimics-NC，空白組未經(jīng)任何干預(yù)。

1.2.2 各組miR-200c檢測 采用real-time PCR法。轉(zhuǎn)染后24 h，使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，以miR-200c逆轉(zhuǎn)錄引物作為莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取反轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行real-time PCR。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min、95 ℃10 s、59 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。miR-200c上游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3′，下游引物：5′-CGCTAATACTGCCGGGTAATG-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATTTT-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。實驗重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計算miR-200c相對表達(dá)量。

1.2.3 各組細(xì)胞凋亡率測算 收集轉(zhuǎn)染后24 h各組HNPCs，以不含EDTA的胰酶消化后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～5)×105/mL，加入Annexin V-FITC染色，隨后加入PI染色，室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 各組Caspase3/7活性檢測 將轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞接種于96孔板，室溫解凍100×Caspase底物和Apo-ONE Caspase3/7緩沖液，將底物與緩沖液按試劑盒說明書混合后，每孔加入100 μL的Caspase試劑混合液，搖床輕搖混均30 s，室溫避光孵育2 h，應(yīng)用ELISA平板計數(shù)器檢測490 nm細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.5 各組TrkB蛋白檢測 取轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度。每組取等量蛋白上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳30 min，室溫5%脫脂牛奶封閉1～2 h，加入適當(dāng)濃度一抗，4 ℃過夜，次日洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后，ECL發(fā)光。用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析，TrkB蛋白的相對表達(dá)量以其與管家基因GAPDH灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-200c表達(dá)比較 觀察組、陰性組和空白組細(xì)胞miR-200c相對表達(dá)量分別為8.11±0.21、1.07±0.04、0.99±0.05，觀察組與陰性組、空白組比較，P均<0.01。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 觀察組、陰性組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為23.6%±3.1%、1.5%±0.2%、1.6%±0.1%,觀察組與陰性組、空白組比較，P均<0.01。

2.3 各組Caspase3/7活性比較 觀察組、陰性組和空白組Caspase3/7活性分別為299.237±24.245、119.476±10.657、117.317±11.317,觀察組與陰性組、空白組比較，P均<0.01。

2.4 各組TrkB蛋白表達(dá)比較 觀察組、陰性組和空白組TrkB蛋白相對表達(dá)量分別為0.48±0.11、0.50±0.12、0.15±0.06,觀察組與陰性組、空白組比較，P均<0.01。

3 討論

髓核細(xì)胞在維持椎間盤的完整性方面起著重要的作用，髓核細(xì)胞能夠產(chǎn)生Ⅱ型膠原、蛋白多聚糖和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分來維持椎間盤的完整性。越來越多的證據(jù)表明，髓核細(xì)胞的凋亡參與了椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究證實miRNA廣泛參與蛋白質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在機(jī)體眾多病理及生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA參與調(diào)控多個靶基因，異常表達(dá)會造成調(diào)控基因的表達(dá)異常，從而參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前miRNA在許多疾病中的作用機(jī)制已經(jīng)被陸續(xù)研究闡明，但是其在椎間盤退變中的研究尚處于起步階段。

研究報道，miR-210在退變髓核組織中表達(dá)明顯降低并且通過靶向HXOA9調(diào)控髓核細(xì)胞的凋亡[10]。miR-138-5p在退變髓核組織中表達(dá)增高，通過SIRT1/PTEN/PI3K/Akt信號通路調(diào)控髓核細(xì)胞的凋亡[11]。miR-200c基因簇定位于12號染色體p13.31，與惡性腫瘤凋亡密切相關(guān)。杜憲紅等[12]發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞通過上調(diào)miR-200c促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。朱名毅等[14]報道，過表達(dá)miR-200c可以抑制舌癌Tca8113細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重腰椎間盤退變患者腰椎間盤組織中miR-200c表達(dá)明顯升高，于是我們推測miR-200c可能與髓核細(xì)胞的過度凋亡有關(guān)。為了模擬椎間盤突出患者椎間盤組織中miR-200c的高表達(dá)狀態(tài)，本研究采用特異性轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine轉(zhuǎn)染miR-200c mimics進(jìn)入體外培養(yǎng)的HNPCs，real-time PCR法檢測證實，轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞中miR-200c表達(dá)量較陰性組和空白組增高，成功在髓核細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-200c。隨后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-200c后髓核細(xì)胞的凋亡率明顯增高，Caspase3/7活性分析進(jìn)一步證實過表達(dá)miR-200c后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)活性酶活性明顯增高，提示miR-200c具有促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡的作用。

miRNA的功能主要取決于其下游靶基因的生物學(xué)效應(yīng)。為了進(jìn)一步探討miR-200c調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制，本研究運用生物學(xué)軟件(TargetScan、miRanda)預(yù)測miR-200c的靶基因可能為神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶2型受體(NTRK2),NTRK2的3′UTR區(qū)存在與miR-200c的種子序列理論上互補的結(jié)合位點。研究[15]發(fā)現(xiàn)，miR-200c在乳腺癌中能夠直接作用于NTRK2，下調(diào)NTRK2促進(jìn)凋亡作用的啟動，并且通過實驗證實上調(diào)NTRK2能有效逆轉(zhuǎn)miR-200c對乳腺癌細(xì)胞的促凋亡作用。因此結(jié)合預(yù)測結(jié)果，本研究推測miR-200c可能調(diào)控NTRK2在髓核組織的退變中起重要作用。NTRK2基因編碼的蛋白質(zhì)稱為TrkB。本研究通過Western blotting法檢測證實，在髓核細(xì)胞過表達(dá)miR-200c后，TrkB蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明在HNPCs中miR-200c與NTRK2之間存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。NTRK2(TrkB)是腦源性生長因子受體，是細(xì)胞增殖、分化、凋亡信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，已有研究證實下調(diào)NTRK2(TrkB)能夠促進(jìn)細(xì)胞的失巢性凋亡[16]，并且能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的失巢凋亡敏感性[15]。可見miR-200c可能通過調(diào)控NTRK2表達(dá)參與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展，有望成為椎間盤退變靶向治療的基因靶點。

綜上可見，過表達(dá)miR-200c能夠促進(jìn)HNPCs的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控TrkB的表達(dá)有關(guān)。

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廣東省佛山市衛(wèi)生和計劃生育局醫(yī)學(xué)科研課題(20160148)。

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2016-11-12)