張煥婷++池穎+++韓之波+曹曉滄

[摘要] 目的 研究人胎盤(pán)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是否能誘導(dǎo)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖。 方法 分離、純化、表型鑒定人胎盤(pán)來(lái)源的MSC。實(shí)驗(yàn)分組如下：PBMC組、PBMC+MSC組、CD3+CD28+PBMC組和MSC+CD3+CD28+PBMC組。相同條件下培養(yǎng)24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例；ELISA法檢測(cè)各組上清中白細(xì)胞介素10（IL-10）水平，并對(duì)MSC+CD3+CD28+PBMC組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例和其上清中IL-10含量作相關(guān)性分析。 結(jié)果 MSC+CD3+CD28+PBMC組中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例為（6.66±2.80）%，PBMC組為（1.01±0.44）%，PBMC+MSC組為（1.14±0.78）%，CD3+CD28+PBMC組為（4.20±2.58）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC組上清中的IL-10含量為（14.45±3.14）pg/mL，PBMC組為（0.90±0.05）pg/mL，PBMC+MSC組為（11.00±3.02）pg/mL，CD3+CD28+PBMC組為（6.04±1.90）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例與其上清中IL-10含量成正相關(guān)（r=0.880，P < 0.01）。 結(jié)論 MSC可以誘導(dǎo)CD3、CD28活化的PBMC細(xì)胞中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例增加與上清中IL-10水平升高有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細(xì)胞；外周血單個(gè)核細(xì)胞；白介素10；CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）02（c）-0008-05

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一群來(lái)源于中胚層的異質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞能在合適的培養(yǎng)條件下分化為骨、軟骨、脂肪甚至神經(jīng)組織，用于受損組織的修復(fù)或治療免疫性疾病[1-2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要是CD4+細(xì)胞群：CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1等。Tr1細(xì)胞首先在人類(lèi)白細(xì)胞抗原不相合胎兒肝臟造血干細(xì)胞移植形成長(zhǎng)期嵌合體的重癥聯(lián)合免疫缺陷患者中發(fā)現(xiàn)[3-4]。Tr1與Th0、Th1及Th2最大的區(qū)別在于其獨(dú)特的細(xì)胞因子格局：IL-2-/low、IL-4-、IL-5+、IFN-γ+、IL-10+、TGF-β+[5-7]。Tr1細(xì)胞本身并不存在于外周血中，而是由CD4+T細(xì)胞在抗原反復(fù)刺激誘導(dǎo)下產(chǎn)生的。Tr1細(xì)胞可通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子治療多種免疫相關(guān)的疾病如哮喘、移植物抗宿主反應(yīng)疾病等[8-9]，因此在免疫學(xué)界的掀起了極大的研究熱潮。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC與PBMC共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖[10-11]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究MSC與CD3、CD28活化的PBMC共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)CD4+CD45RA- CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖的情況及CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞對(duì)上清中IL-10水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基、DF-12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，PE標(biāo)記的小鼠抗人CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166抗體以及PE標(biāo)記的小鼠抗人CD4抗體，PE-Cy7標(biāo)記的小鼠抗人CD45RA抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗人CD49b抗體，APC標(biāo)記的小鼠抗人LAG3抗體，同型對(duì)照抗體，抗CD3、CD28抗體，IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Biolegend公司。人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)?yáng)公司。收集2016年3～6月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院就診患者的血樣13個(gè)，研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分離、純化及鑒定

胎盤(pán)由天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院健康足月產(chǎn)產(chǎn)婦捐獻(xiàn)，簽署知情同意書(shū)。將胎盤(pán)剪成1 cm3左右的小塊，經(jīng)膠原酶酶II消化、淋巴細(xì)胞分離液離心、濾網(wǎng)過(guò)濾制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃孵箱中，48 h后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，胰酶消化，分瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。3 d換液1次，7～8 d傳代1次。擴(kuò)增大量的3代細(xì)胞用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)分析MSC表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166。

1.2.2 人外周血T細(xì)胞的分離

取適量的淋巴細(xì)胞分離液置于50 mL的無(wú)菌離心管，5 mL肝素抗凝血與等量無(wú)菌PBS充分混勻后緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，2000 r/min離心20 min。將彎頭滴管插入云霧層仔細(xì)吸取上、中層界面處的云霧層細(xì)胞置入另一離心管中，加入10倍體積的RPMI1640液，1500 r/min離心10 min，洗滌2次，棄上清，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。

1.2.3 MSC對(duì)各組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影響

取1 mL調(diào)整至1×105/mL的第3代MSC接種于6孔板內(nèi)，完全貼壁后，經(jīng)60Co照射后棄去培養(yǎng)基。將1 mL PBMC混懸液接種于上述的6孔培養(yǎng)板中，加入CD3+CD28（終濃度20 μg/mL）。實(shí)驗(yàn)組分為PBMC、PBMC+MSC、PBMC+CD3+CD28和PBMC+CD3+CD28+MSC 4個(gè)組。37℃培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，加入由PE、PE-Cy7、FITC、APC分別標(biāo)記的CD4、CD45RA、CD49b、LAG3抗體，4°C避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例。

1.2.4 MSC對(duì)各組IL-10水平的影響

取上述4組培養(yǎng)體系的上清，-80℃保存待檢。ELISA法檢測(cè)各組的IL-10水平，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析以及SNK法多重比較，相關(guān)分析采用Pearson分析法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC的分離、純化及鑒定

原代分離的MSC只有少數(shù)貼壁生長(zhǎng)，換液后MSC生長(zhǎng)加快，形態(tài)不均一。1周后細(xì)胞成克隆樣生長(zhǎng)，2周后細(xì)胞成漩渦狀生長(zhǎng)，3周后細(xì)胞匯集成片，融合度達(dá)90%，3代后的細(xì)胞形態(tài)呈均一的長(zhǎng)梭形（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)分析MSC表型為：CD14-、CD34-、CD45-、CD29+、CD44+、CD105+、CD106+和CD166+（圖1B）。

2.2 MSC對(duì)CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影響

研究采用CD4、CD45RA、CD49b與LAG3抗體標(biāo)記鑒定Tr1細(xì)胞（圖2）。流式細(xì)胞術(shù)分析各組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例，MSC+PBMC+CD3+CD28組為（6.66±2.80）%，PBMC組為（1.01±0.44）%，PBMC+CD3+CD28組為（4.20±2.58）%，MSC+PBMC組為（1.14±0.78）%，可見(jiàn)MSC+PBMC+CD3+CD28組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 MSC對(duì)上清中IL-10水平的影響

在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后經(jīng)ELISA法檢測(cè)4組上清中的IL-10水平。結(jié)果表明MSC+PBMC+CD3+CD28組的IL-10水平為（14.45±3.14）pg/mL，PBMC+CD3+CD28組為（6.04±1.90）pg/mL，PBMC組為（0.90±0.05）pg/mL，MSC+PBMC組為（11.00±3.02）pg/mL。數(shù)據(jù)分析表明CD3+CD28+PBMC+MSC組的IL-10水平顯著高于PBMC+CD3+CD28組和PBMC組（P < 0.05），但與MSC+PBMC組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。此外，MSC+PBMC+CD3+CD28組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例與其上清中IL-10水平為正相關(guān)（r=0.880，P < 0.01）。見(jiàn)圖4。

3 討論

人類(lèi)MSC具有高度的自我更新和多向分化潛能，在合適的培養(yǎng)基中可向多種組織方向分化，包括成骨細(xì)胞、軟骨、脂肪、肌肉、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，因此在組織工程和臨床細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用[1，12-13]。胎盤(pán)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其取材方便，來(lái)源充足，不受倫理的限制，受到國(guó)內(nèi)外免疫學(xué)學(xué)者的關(guān)注[14-16]。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSC能夠誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖，但MSC是否能夠誘導(dǎo)PBMC中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖還未可知。

Tr1細(xì)胞主要是由CD4+T細(xì)胞經(jīng)IL-10誘導(dǎo)產(chǎn)生的，以分泌高水平的IL-10和TGF-β為特征，其可能通過(guò)非細(xì)胞接觸依賴的IL-10分泌發(fā)揮抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生的作用[17]。過(guò)去Tr1因缺乏特異性表面標(biāo)志無(wú)法對(duì)其進(jìn)行分析與分離。Groux等[7]發(fā)現(xiàn)兩個(gè)用于鑒定Tr1的選擇性表面標(biāo)志—CD49b與LAG3。本研究利用這兩個(gè)標(biāo)志對(duì)MSC是否能誘導(dǎo)產(chǎn)生Tr1細(xì)胞進(jìn)行了分析。

本研究發(fā)現(xiàn)人胎盤(pán)來(lái)源的MSC能誘導(dǎo)經(jīng)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖。機(jī)制可能是MSC本身就具有免疫調(diào)節(jié)能力，其本身通過(guò)分泌IL-10作用于PBMC中的CD4+細(xì)胞促進(jìn)其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，也可能是MSC分泌的細(xì)胞因子作用于PBMC中的單核細(xì)胞，如M2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌IL-10，再作用于CD4+細(xì)胞使其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞分泌的IL-10再作用于CD4+細(xì)胞，從而形成正反饋增加Tr1細(xì)胞的產(chǎn)生[18-20]。本研究證實(shí)MSC可以誘導(dǎo)經(jīng)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并提高上清中IL-10水平。但I(xiàn)L-10可能來(lái)源于CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞，也可能來(lái)源于MSC甚至是單核細(xì)胞，將來(lái)的研究需進(jìn)一步研究IL-10的來(lái)源。本文研究了CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例和上清中IL-10水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MSC與CD3、CD28活化的PBMC共培養(yǎng)后誘導(dǎo)的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1與上清中IL-10水平有正相關(guān)的關(guān)系。由此推測(cè)共培養(yǎng)上清中增高的IL-10有可能與CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例升高有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MSC能誘導(dǎo)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并能提高培養(yǎng)體系上清中的IL-10水平。本研究為臨床應(yīng)用MSC治療自身免疫性疾病、過(guò)敏性反應(yīng)、慢性炎癥性疾病、移植排斥及腫瘤等因免疫失調(diào)引起的疾病提供了新的依據(jù)和手段。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Stavely R. Human adult stem cells derived from adipose tissue and bone marrow attenuate enteric neuropathy in the guinea-pig model of acute colitis [J]. Stem Cell Res Ther，2015，6（1）： 244-265.

[2] Bernardo ME，Pagliara D，Locatelli F. Mesenchymal stromal cell therapy：arevolution in regenerative medicine？[J]. Bone marrow transplantation，2012，47（2）：164-171.

[3] Roncarolo MG，Gregori S，Battaglia M，et al. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans [J]. Immunological reviews，2006，212（1）：28-50.

[4] Bacchetta R， Bigler M， Touraine J L， et al. High levels of interleukin 10 production in vivo are associated with tolerance in SCID patients transplanted with HLA mismatched hematopoietic stem cells [J]. Journal of Experimental Medicine，1994，179（2）：493-502.

[5] Roncarolo MG，Gregori S，Lucarelli B，et al. Clinical tolerance in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation [J]. Immunological reviews，2011，241（1）：145-163.

[6] Pot C，Apetoh L，Kuchroo V K. Type 1 regulatory T cells（Tr1）in autoimmunity [J]. Seminars in immunology，2011， 23（3）：202-208.

[7] Groux H，O'Garra A，Bigler M，et al. A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis [J]. Nature，1997，389（6652）：737-742.

[8] Magnani CF，Alberigo G，Bacchetta R，et al. Killing of myeloid APCs via HLA class I，CD2 and CD226 defines a novel mechanism of suppression by human Tr1 cells [J]. European Journal of Immunology，2011，41（6）：1652-1662.

[9] Levings MK，Sangregorio R，Galbiati F，et al. IFN-alpha and IL-10 induce thedifferentiation of human type 1 T regulatory cells [J]. Journal of Immunology，2001，166（9）：5530-5539.

[10] Gagliani N，Magnani C F，Huber S，et al. Coexpression of CD49b and LAG-3 identifies human and mouse T regulatory type 1 cells [J]. Nature Medicine，2013，19（6）：739-746.

[11] Stampfli MR，Cwiartka M.Interleukin-10 gene transfer to the airway regulates allergic mucosal sensitization in mice [J]. Am J Respir.Cell Mol Bid，1999，21（5）：586-596.

[12] Salem HK，Thiemermann C. Mesenchymal stromal cells：current understanding andclinical status [J]. Stem cells，2010，28（3）：585-596.

[13] Di IM，Del PB，De IM，et al. Mesenchymal cells recruit and regulate T regulatory cells [J]. Experimental hematology，2008，36（3）：309-318.

[14] Ringden O，Uzunel M，Rasmusson I，et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease [J]. Transplantation，2006，81（10）：1390-1397.

[15] Le Blanc K，F(xiàn)rassoni F，Ball L，et al. Mesenchymal stem cells for treatment ofsteroid-resistant，severe，acute graft-versus-host disease：a phase II study [J]. Lancet，2008， 371（9624）：1579-1586.

[16] Le Blanc K，Mougiakakos D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system [J]. Nature reviews Immunology，2012，12（5）：383-396.

[17] 尹靈梅，陳黎，張鈾，等.Tr1細(xì)胞免疫調(diào)控與移植物抗宿主病的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（5）：622-625.

[18] Melief SM，Schrama E，Brugman MH，et al. Multipotent stromal cells inducehuman regulatory T cells through a novel pathway involving skewing of monocytes toward anti-inflammatory macrophages [J]. Stem cells，2013，31（9）：1980-1991.

[19] Wang D，Chen K，Du W T，et al. CD14+ monocytes promote the immunosuppressive effect of human umbilical cord matrix stem cells [J]. Experimental cell research，2010， 316（15）：2414-2123.

[20] Chen K，Wang D，Du WT，et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells hUC-MSCs exert immunosuppressive activities through a PGE2-dependent mechanism [J]. Clinical immunology，2010，135（3）：448-458.

（收稿日期：2016-11-21 本文編輯：李岳澤）