李偉+王加志+曲巖+王興焱+陳景華

[摘要] 目的 探討不同濃度阿魏酸對UVB誘導(dǎo)的A375細(xì)胞黑素生成的影響及其作用機制。 方法 常規(guī)體外培養(yǎng)A375細(xì)胞，分為空白組、模型組、阿魏酸低濃度（10 μmol/L）組、阿魏酸高濃度（100 μmol/L）組和陽性對照組，除空白組外，各組均以UVB 20 mJ/cm2照射，阿魏酸高低濃度組加含阿魏酸的培養(yǎng)液、陽性對照組加入含熊果苷的培養(yǎng)液作用24 h，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法測定細(xì)胞增殖；采用多巴氧化法研究酪氨酸酶活性的變化；比色法測定黑素含量，免疫印跡法測定C-KIT和MITF蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與空白組比較，模型組細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素含量明顯增加，阿魏酸低、高濃度組和陽性對照組均可抑制UVB誘導(dǎo)的A375細(xì)胞酪氨酸酶活性增高和黑素生成，其機制可能是通過下調(diào)C-KIT和MITF蛋白表達(dá)而實現(xiàn)的。 結(jié)論 高濃度阿魏酸可明顯下調(diào)C-KIT/MITF蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制酪氨酸酶活性和黑素生成。

[關(guān)鍵詞] 阿魏酸；C-KIT/MITF；黑變?。缓谒睾铣?/p>

[中圖分類號] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0028-04

瑞爾黑變?。≧iehl's Melanosis）是一種以面頸部灰紫色或灰褐色色素沉著為主要表現(xiàn)的皮膚病[1]。本病在形態(tài)學(xué)上以色素失禁為主要表現(xiàn)[2]，嚴(yán)重影響患者的容貌，以成年人多見，女性多于男性。皮損主要常見于面頸部。紫外線是本病發(fā)生的重要誘因[3]。阿魏酸為苯丙烯酸類化合物，是中藥當(dāng)歸的主要活性成分，分子量為194.18。有研究表明[4-5]，阿魏酸有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞紫外線損傷等作用。體外研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，阿魏酸在體外對蘑菇酪氨酸酶呈可逆性的競爭性抑制，而阿魏酸對UVB造成的黑素細(xì)胞色素生成作用的影響則未見報導(dǎo)。本研究在前期當(dāng)歸水提液的抗色素作用工作基礎(chǔ)上[8]，通過探討干細(xì)胞因子受體（C-KIT）和小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MiTF）蛋白表量差異，分析活性成分阿魏酸對酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性和黑素生成的作用機制，為瑞爾黑變病等色素沉著性疾病的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（0773-9910）購自中國藥品生物制品檢定所；人黑素瘤細(xì)胞（A375）購于武漢細(xì)胞典藏中心；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）（BiLLab公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京中杉金橋有限公司）；熊果苷、左旋多巴（L-dopa）、TritonX-100、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子一抗（MITF D5G7V Rabbit mAb #12590），干細(xì)胞因子受體一抗（C-KIT D13A2 XPTM Rabbit mAb #3074），甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH抗體（Rabbit mAb #2118），辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗（#7074）以上抗體均購于Cell Signaling Technology USA。紫外照射儀，紫外線輻照計（北京師范大學(xué)光電儀器廠），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD USA），MK3型酶標(biāo)儀（熱電上海儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與受試藥

在A375細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，經(jīng)胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，用紅細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。阿魏酸配成濃度為2.57 mmol/L的貯備液，通過培養(yǎng)液稀釋，最終得到濃度為100 μmol/L～0.01 nmol/L 8個濃度組，將分為空白對照組、模型組、阿魏酸低濃度、阿魏酸高濃度和陽性對照組5組，熊果苷為陽性對照藥。模型組和給藥組均用中波紫外線（UVB）20 mJ/cm2照射[9]，給藥組在照射后給予不同濃度藥物作用24 h。

1.3 MTT檢測A375細(xì)胞的增殖抑制率

將濃度為5.0×104個/mL的A375細(xì)胞接種在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2，37℃培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)液，陽性對照組加入含1.1 mmol/L熊果苷的培養(yǎng)基，實驗組分別加入含阿魏酸不同濃度的培養(yǎng)基，每孔200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)20 h。棄培養(yǎng)基，每孔加5 g/L的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37℃震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度值（A）。細(xì)胞增殖活性用A490值表示。

1.4黑素含量的測定

調(diào)整A375細(xì)胞濃度約為4.5×104個/mL接種在6孔板中，每孔2 mL，5%CO2，37℃培養(yǎng)12 h。陽性對照組加入1.1 mmol/L熊果苷，實驗組加入含各濃度阿魏酸的培養(yǎng)基，每孔2 mL，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，經(jīng)胰酶消化后，加入2 mL DMEM培養(yǎng)基中止消化，吹打成細(xì)胞懸液，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，然后加入1 mol/L NaOH的100 μL，37℃水浴1 h，再加入400 μL去離子水充分混勻后，吸取100 μL/孔加至96孔板，在490 nm波長測定各孔A值。黑素含量用A490值表示。

1.5 酪氨酸酶（TYR）活性

調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×104個/mL接種在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2培養(yǎng)12 h?？瞻捉M不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液，陽性對照組加入1.1 mmol/L熊果苷，實驗組加入含阿魏酸各濃度的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100 μL，反復(fù)凍融使細(xì)胞充分裂解。加入0.5%L DOPA溶液50 μL/孔，37℃下反應(yīng)3 h，490 nm波長處測定各孔A值。TYR活性A490值表示。

1.6 Western blot分析

收集不同濃度阿魏酸作用24 h后的A375細(xì)胞，置冰上用RIPA蛋白裂解液充分裂解，14 000 r/min離心15 min，小心收集上清，BCA法測定蛋白濃度。將各受試組總蛋白配成統(tǒng)一濃度后加入5X上樣緩沖液混勻，100℃水浴中加熱10 min，取50 μg總蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜（100 V，90 min），5%脫脂奶粉（1XTBST配制）室溫封閉1 h，一抗用MITF、C-KIT抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后用ECL試劑室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測，曝光時間10 s，共10張。內(nèi)參為GAPDH。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測阿魏酸對A375細(xì)胞的增殖抑制率

與空白對照組比較，阿魏酸各濃度下對細(xì)胞增殖不產(chǎn)生抑制作用，10、100 μmol/L可以觀察到增殖作用趨勢，所以本研究組選擇這2個濃度作為后續(xù)實驗的使用濃度，將10 μmol/L濃度組命名為阿魏酸低濃度組，100 μmol/L濃度組命名為阿魏酸高濃度組。見圖1。

2.2 阿魏酸對TYR活性及黑素含量的影響

與空白對照組比較，UVB引起的黑素合成和TYR活性顯著升高（P < 0.01）；與模型組比較，阿魏酸各濃度組和陽性對照組均對其產(chǎn)生顯著的抑制作用，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），并呈一定的劑量依賴關(guān)系，阿魏酸低濃度組抑制作用弱于陽性對照組（P < 0.05），阿魏酸高濃度組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 阿魏酸、UVB對C-KIT和MITF蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，UVB對MITF和C-KIT蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，而陽性對照藥熊果苷和阿魏酸對MITF和C-KIT蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，呈一定的劑量依賴關(guān)系。見圖2。

3 討論

UVB的照射引起黑素生成、轉(zhuǎn)運和代謝異常與C-KIT/MITF/TYR通路調(diào)控異常關(guān)系密切[10-11]，C-KIT是表達(dá)于黑素細(xì)胞表面、具有酪氨酸激酶活性的Ⅲ型跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族，由原癌基因C-KIT編碼，其相對分子量為14 500。己發(fā)現(xiàn)瑞爾黑變病在發(fā)病前或是發(fā)病過程中出現(xiàn)C-KIT表達(dá)水平的異常[12]。MITF是SCF/Kit信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游分子，也是TYR等黑素生成重要分子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子開關(guān)（molecular switchboard）[13-15]，在黑素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能等方面發(fā)揮著重要的作用，這也將成為色素障礙性皮膚病的主要作用靶點[16]。

熊果苷作為常用的脫色劑，有明顯的抑制酪氨酸酶活性，減少黑素生成的作用，但已有發(fā)生不良反應(yīng)的報道[17]。為此有必要從中藥中尋找有調(diào)節(jié)黑色素作用又安全的化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)報道當(dāng)歸及含當(dāng)歸方劑有抑制酪氨酸酶活性的作用[18]，結(jié)合本課題組前期工作用基礎(chǔ)，本研究以A375細(xì)胞為研究對象，當(dāng)歸活性成分阿魏酸為受試藥物進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果提示，UVB可誘導(dǎo)A375細(xì)胞酪氨酸酶活性升高，黑素生成量增加，在作用上則表現(xiàn)為上調(diào)C-KIT和MITF蛋白表達(dá)，兩者呈正相關(guān)。阿魏酸在10、100 μmol/L濃度均可降低A375細(xì)胞的酪氨酸酶活性并減少黑素生成，下調(diào)C-KIT和MITF蛋白表達(dá)，但高劑量組作用更明顯。體外研究顯示出阿魏酸有抑制酪氨酸酶活性的作用，在細(xì)胞實驗中，阿魏酸作用于膜受體還是被細(xì)胞內(nèi)吞而接觸到酪氨酸酶而起作用尚不清楚，本研究所觀察到的抑制C-KIT和MITF蛋白表達(dá)可能是其抗色素沉著作用的機制之一。黑變病的病位在表皮、真皮層，在治療上口服藥物分布到皮膚的有效藥物濃度較低，經(jīng)皮給藥是最佳方案。有研究報道[19]，阿魏酸分子型易透過皮膚，直接作用于病變部位，在充分闡釋其作用機制的基礎(chǔ)上，有望將阿魏酸開發(fā)成為功效型化妝品用于色素性皮膚病的預(yù)防或治療[20]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 孟慧敏，周成霞，李利.瑞爾黑變病病因與發(fā)病機制研究進(jìn)展[J].中國生物美容，2009，（4）：60-63.

[2] 李桐，李利.里爾黑變病發(fā)病機制與治療研究進(jìn)展[J].實用皮膚病學(xué)雜志，2015，8（6）：446-452.

[3] Scott G，Deng A，Rodriguez-Burford C，et al. Protease-activatedreceptor 2，a receptorinvolved in melanosome transfer，is upregulated in humanskin by ultraviolet irradiation [J]. The Journal of Investigative Dermatology，2001，117（6）：1412-1420.

[4] 胡益勇，徐曉玉.阿魏酸的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2006，28（2）：253-255.

[5] 劉淑穎，駱丹.阿魏酸對UVB導(dǎo)致人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18（8）：1102-1104.

[6] 金一瓊，陳周譚，賴富饒，等.曲酸與阿魏酸對酪氨酸酶的抑制作用研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（4）： 379-381 .

[7] Gong SZ，Cheng J，Yang ZR. Inhibitory effect of ferulic acid on oxidation of L-DOPA catalyzed by mushroom tyrosinase [J]. Chinese J Chem Eng，2005，13（6）：771-775.

[8] 陳景華，王興焱，王雪，等.當(dāng)歸提取物對黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型黑素合成的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（17）：205-208.

[9] 吳姍姍，許歡歡，朱丹丹，等.UVB輻射對黑色素細(xì)胞黑素合成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，39（4）：422-429.

[10] 王鷹，李海東，劉樹雷.NB-UVB對角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞SCF、KIT、MITF表達(dá)的調(diào)控作用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（2）：110-112.

[11] 姚蕾，鐘淑霞，蘭珊珊，等.黃芩苷聯(lián)合NB-UVB對黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014，40（5）：1024-1027.

[12] 賀中華.瑞爾黑變病皮損中C-KIT和PAR2表達(dá)水平研究[D].山西：山西醫(yī)科大學(xué)，2015.

[13] Steingrímsson E，Copeland NG，Jenkins NA. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network [J]. Annu Rev Genet，2004，38：365-411.

[14] 黎釗，王平，洪為松，等.正常人黑素細(xì)胞MITF 對酪氨酸酶相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013， 42（3）：58-62.

[15] 楊慧蘭，陳波，梁潔，等.復(fù)方中藥對小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶與MITF mRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，118（110）：1477-1479.

[16] 趙光，楊文信.黑色素細(xì)胞的研究近況[J].西南軍醫(yī)，2013，15（2）：177-181.

[l7] 張春香，盛玉清.熊果苷和維生素C鈉對黑色素生成的抑制作用[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2006，14（4）：220-222.

[18] 謝家寶，洪遜強，劉利利，等.色象中藥對人A375黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響[J].陜西中醫(yī)，2011，32（3）：361-363.

[19] 畢建云，劉善新，靳光乾，等.阿魏酸透皮吸收研究綜述[J].中藥材，2013，36（6）：1028-1031.

[20] 劉艷紅，楊子佳，祝鈞.阿魏酸酯類衍生物的制備及其在化妝品中的應(yīng)用[J].化學(xué)世界，2014，（11）：701-704.

（收稿日期：2016-11-09 本文編輯：蘇 暢）