馮東凡+范東旭+金松+韓梅++楊婷+劉彥東++王凱峰++孫瑤

[摘要] 目的 探討γ-分泌酶抑制劑（DAPT）對(duì)體外培養(yǎng)糖尿?。―M）大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 方法 體外培養(yǎng)DM大鼠VSMCs，隨機(jī)分為兩組：正常培養(yǎng)基組（con組）、加入不同濃度（0.15、2.50、7.50 μmol/L）DAPT的培養(yǎng)基組（實(shí)驗(yàn)組），72 h后收集細(xì)胞，分別用雙向電泳方法和Western blot法檢測(cè)Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 ①雙向電泳圖譜證實(shí)提取的蛋白中含有目的蛋白。②Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白的表達(dá)均遞減；7.50 μmol/L組與對(duì)con組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；0.15、1.25 μmol/L組與con組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組與1.25 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 DAPT作用于體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs后，使其Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)減少，在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～7.50 μmol/L）呈濃度依賴性。

[關(guān)鍵詞] Notch信號(hào)通路；γ-分泌酶抑制劑；血管平滑肌細(xì)胞；雙向電泳

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04

糖尿病足（DF）是糖尿?。―M）的慢性并發(fā)癥之一，是高血糖、周圍血管病變、周圍神經(jīng)病變等多種因素共同所致，病因復(fù)雜，致殘、致死率高，治療費(fèi)用高。目前針對(duì)DF及微血管病變的治療效果難以令人滿意。Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)非DM動(dòng)物缺血區(qū)血管新生、動(dòng)靜脈分化等作用。本課題通過γ-分泌酶抑制劑（DAPT）干預(yù)體外培養(yǎng)的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs），研究對(duì)Notch信號(hào)通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

凍存的DM大鼠VSMCs（SPF級(jí)SD大鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量合格證號(hào)：0003546，經(jīng)DM大鼠模型建立、取材后凍存）[1]。

1.2 主要試劑和儀器

DAPT（美國(guó)Sellect公司）；全自動(dòng)凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（北航圖像中心）；蛋白濃度測(cè)定試劑、β-actin（美國(guó)Sigma公司）；兔抗Notch1單克隆抗體、兔抗Notch3單克隆抗體、兔抗Notch4單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-2蛋白（JAG2）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠DLL4蛋白單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)、IEF電泳槽、IPG預(yù)制膠條（美國(guó)BioRad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的DM大鼠VSMCs進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將其接種于96孔板，D-Hank′s液沖洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA·4Na約3 mL進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液。按1∶2傳代培養(yǎng)，傳至3代后，隨機(jī)分為兩組：正常培養(yǎng)基（con）組和加入DAPT的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)）組（濃度梯度分別為0.15、1.25、7.50 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)傳至6代。

1.4 方法

1.4.1 蛋白提取 取配置好的單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液400 mL，冰浴靜置40 min，提取蛋白。

1.4.2 雙向電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝膠上，標(biāo)記縱橫坐標(biāo)，將目的蛋白加入坐標(biāo)原點(diǎn)，進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，聚焦結(jié)束后的膠條經(jīng)平衡處理后立即進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，拍照，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件分析處理。取提取的蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣量。煮沸，變性，標(biāo)記，上樣檢測(cè)或于-80℃保存。

1.4.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況 取30 μg蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，加入二抗IgG（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以對(duì)照組為參照樣本，計(jì)算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳檢測(cè)結(jié)果

DM大鼠VSMCs蛋白雙向電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在凝膠上可以看到800多個(gè)蛋白點(diǎn)，其中大多數(shù)蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量為134～300 kD。應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示計(jì)算機(jī)探測(cè)到的凝膠分離出的蛋白質(zhì)點(diǎn)，“標(biāo)簽”表示經(jīng)過計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)編號(hào)后的目標(biāo)蛋白點(diǎn)，說明提取的蛋白質(zhì)中含有實(shí)驗(yàn)所需目的蛋白。見圖1。

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表達(dá)水平遞減；7.50 μmol/L組與con組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L組與con組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組和1.25 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

3 討論

DM已成為世界性疾病[2]，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的2015全球DM版圖[3]，目前世界成年DM患者約4.15億人，中國(guó)目前為1.096億人，且處于不斷增加中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，15%～25%的DM患者一生中會(huì)發(fā)生DF[4]，而DM患者的截肢率與非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)[6]截肢后5年死亡率達(dá)40%。

在DM血管病變過程中，VSMCs從中膜移行到內(nèi)膜，增殖、分泌生長(zhǎng)因子，參與纖維膜的形成，VSMCs還分泌合成許多基質(zhì)分子參與血管病變的發(fā)生[7-8]。因此可見，VSMCs在DM血管病變的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。

目前針對(duì)DM血管病變的治療主要以內(nèi)科藥物保守治療、腔內(nèi)介入手術(shù)[9]、旁路移植手術(shù)[10]為主，但效果均欠佳，近年來開展的細(xì)胞因子治療[11]用于誘導(dǎo)和促進(jìn)DM血管缺血區(qū)血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，尋求新的方式以促進(jìn)更多血管生成是非常有必要的。

有研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非DM動(dòng)脈缺血區(qū)的血管新生[12-14]，在血管發(fā)育的過程中發(fā)揮重要的作用。在Notch信號(hào)通路的受體和配體中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)[15]。Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配體啟動(dòng)[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]證實(shí)Notch信號(hào)通路對(duì)體外培養(yǎng)正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。但是Notch信號(hào)通路是否對(duì)DM動(dòng)脈缺血區(qū)具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信號(hào)通路的抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進(jìn)而抑制Notch受體在S3位點(diǎn)的酶切，有效抑制Notch信號(hào)通路的激活[20]。

本課題組既往實(shí)驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)證實(shí)，體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs經(jīng)DAPT作用72 h，對(duì)其細(xì)胞的抑制率較其余各時(shí)間段明顯，且當(dāng)DAPT濃度在0.25、1.25、7.50 μmol/L時(shí)，其半抑制率最為明顯[1]，所以本實(shí)驗(yàn)選用以上3個(gè)濃度的DAPT作用72 h后行相關(guān)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組與con組提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行雙向電泳及Western blot檢測(cè)證實(shí)DAPT可以抑制Notch信號(hào)通路的活動(dòng)，抑制Notch相關(guān)蛋白的表達(dá)。雙向電泳圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot檢查結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，各蛋白的表達(dá)均遞減，說明DAPT干預(yù)Notch信號(hào)通路能抑制DM大鼠Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；其中，當(dāng)DAPT濃度在7.50 μmol/L時(shí)，對(duì)Notch信號(hào)通路各蛋白表達(dá)的抑制作用最明顯；當(dāng)DAPT濃度在0.15～1.25 μmol/L之間時(shí)，干預(yù)Notch信號(hào)通路后對(duì)相關(guān)蛋白的抑制作用無明顯差異；當(dāng)DAPT濃度在1.25～7.50 μmol/L之間時(shí)，隨著濃度的升高，DAPT對(duì)Notch信號(hào)通路的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴型。從結(jié)果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分別與Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，證實(shí)了Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配體啟動(dòng)這一理論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在體外正常條件下培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs中均有所表達(dá)；且DAPT能不同程度阻斷DM大鼠VSMCs Notch信號(hào)通路的活性，抑制Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，且該抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～7.50 μmol/L）呈正相關(guān)。結(jié)合本課題前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)DAPT干預(yù)Notch信號(hào)通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促進(jìn)凋亡等，提示Notch信號(hào)通路與DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有關(guān)。此項(xiàng)研究提示，促進(jìn)Notch信號(hào)通路的表達(dá)或許可以促進(jìn)DM患者缺血區(qū)VSMCs的增殖，促進(jìn)更多新生血管的再生，但目前對(duì)Notch信號(hào)通路在DM患者中的具體機(jī)制還存在許多亟需解決的問題。

總之，DAPT干預(yù)DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制Notch信號(hào)通路的活性，證明Notch信號(hào)通路在DM大鼠血管再生中起著重要作用，而進(jìn)一步研究Notch信號(hào)通路在DM大鼠中的作用機(jī)制或許為治療DM患者缺血區(qū)血管新生提供一種新的可能。

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：程 銘）