王琳+范云峰+粱建生

摘要：為更好地溶解水稻葉片疏水蛋白，比較4種常用裂解液{分別含有4% 3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、2% CHAPS+2% SB3-10、4% ASB-14、4% TritonX-100去垢劑}配方對(duì)水稻葉片疏水蛋白溶解性的影響。結(jié)果表明，含有4% CHAPS去垢劑的裂解液對(duì)水稻葉片疏水蛋白的溶解效果最佳。

關(guān)鍵詞：雙向電泳；裂解液；疏水蛋白；溶解效果

中圖分類號(hào)： S188；S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0054-02

收稿日期：2017-3-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31271622）；揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金（編號(hào)：2016CXJ087）。

作者簡(jiǎn)介：王 琳（1978—），女，江蘇徐州人，博士，講師，主要從事植物生理和生化研究。E-mail：wanglin@yzu.edu.cn。

通信作者：梁建生，博士，教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。Tel：（0514）87979054；E-mail：jssliang@163.com。 雙向電泳（2-DE）中樣品裂解液發(fā)展最大的限制來源于既要盡可能充分地溶解樣品，又要保證不影響等電聚焦（isoelectric-focusing，簡(jiǎn)稱IEF）。對(duì)于膜蛋白，用脲和硫脲組合作為離液劑已成共識(shí)[1-5]，所以選擇恰當(dāng)?shù)娜ス竸┦歉倪M(jìn)裂解液配方的突破口。去垢劑主要有離子型、非離子型和兼性離子型3類。離子型去垢劑一般不用于IEF，以十二烷基硫酸鈉（SDS）為代表。傳統(tǒng)的非離子型去垢劑多以聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）和脂肪醇聚氧乙烯醚（NP-40）為代表，兼性離子型以3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）為代表。CHAPS有較強(qiáng)的溶解疏水蛋白的能力，現(xiàn)在較為常用。此外，一些新的兼性離子去垢劑如SB3-10、氨基磺酸甜菜堿-14（ASB-14）也越來越多地被應(yīng)用到2-DE中。有研究認(rèn)為，SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果更好一些[6]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，ASB-14溶解膜蛋白的效果優(yōu)于SB3-10和CHAPS的組合[7]。但對(duì)于水稻葉片疏水蛋白的溶解效果，哪種去垢劑最好，目前的研究還沒有確定的答案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以水稻品種日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑

雙向電泳系統(tǒng)（Bio-RAD）、線性固相pH梯度（immobilize pH gradients，簡(jiǎn)稱IPG）預(yù)制膠條（Bio-RAD），IPG緩沖液、覆蓋液、3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸購(gòu)自Amersham pharmacia公司；尿素、四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dethilthreitol，簡(jiǎn)稱DTT）、甘氨酸、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺均購(gòu)自Amresco公司；其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；所有溶液和緩沖液均使用MilliQ系統(tǒng)提供的電阻不小18.2 MΩ的去離子水。

1.3 水稻葉片疏水蛋白的制備、沉淀與保存

取水稻鮮葉約10 g，凍干，用粉碎機(jī)粉碎凍干葉片，篩出葉片粉末，加入40 mmol/L Tris-HCl（pH值8.4），振蕩 10 min，超聲波處理1 min，4 ℃、21 697 r/min離心1 h，取上清，留沉淀，反復(fù)多次，直至Bradford法測(cè)得的上清液蛋白質(zhì)濃度為0，最終沉淀中所含的蛋白質(zhì)即為水稻葉片的疏水蛋白，將沉淀真空凍干，于-78 ℃保存。

在水稻葉片疏水蛋白凍干粉中加入250 μL 4種不同的裂解液A（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS）、裂解液B（含7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，2% CHAPS和2% SB3-10）、裂解液C（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% ASB-14）和裂解液D（含 7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% TritonX-100），30 ℃水浴 1 h，其間充分振蕩，超聲波處理3次（50 s/次），20 ℃、14 953 r/min 離心15 min，取上清，用Bradford法測(cè)上清液的蛋白質(zhì)濃度。

1.4 雙向電泳

配制含150 μg蛋白質(zhì)的水化液，重水化pH值4～7的IPG膠條，等電聚焦35 000 Vh。平衡膠條。將膠條移至二向12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠上，進(jìn)行二向電泳，電泳結(jié)束后剝膠，銀染法染色顯示蛋白質(zhì)點(diǎn)[8]。掃描儀掃描雙向電泳凝膠圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

目前針對(duì)膜蛋白質(zhì)的溶解有多種方法，在不同情況下其溶解效果不同，但在特定情況下卻各有優(yōu)勢(shì)。在2-DE中，對(duì)膜蛋白的溶解用脲和硫脲的組合作為離液劑已成共識(shí)，所以各種膜蛋白質(zhì)裂解液的最大不同來自于對(duì)不同的非離子型或兼性離子型去垢劑的使用。本試驗(yàn)比較了目前在2-DE膜蛋白質(zhì)溶解中應(yīng)用較為普遍的4種裂解液[9-12]的蛋白溶解效果。

從圖1可以看出，雖然是相同的上樣量 100 μg，但是A、B、C、D 4種裂解液的結(jié)果卻是有差別的。A和B要好于C和D，因?yàn)锳和B的2-DE圖譜上有更多蛋白質(zhì)點(diǎn)（接近1 500個(gè)），C和D只有1 200個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。在本試驗(yàn)中 ASB-14會(huì)使分子量較低的蛋白質(zhì)在酸性端模糊難辨（圖1-C的Ⅰ區(qū)域）。這種結(jié)果不但使2-DE的覆蓋率大大降低，而且會(huì)影響到2-DE的重復(fù)性，從而增大了變異系數(shù)和分析難度，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖1-D的區(qū)域Ⅱ、Ⅲ與圖1-A和圖1-B中的相同區(qū)域相比，不但蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)少，而且相同蛋白質(zhì)的灰度值也不及圖1-A和圖1-B，但是圖1-D的這2個(gè)區(qū)域與圖1-C相比，結(jié)果較好。因此認(rèn)為在2-DE中，用裂解液A和B溶解水稻葉片的疏水蛋白的效果要好于D，D的效果優(yōu)于C。endprint

2-DE是全面分析蛋白質(zhì)的技術(shù)，比較A和B，雖然兩者都有高效溶解蛋白質(zhì)的能力，但是兩者對(duì)特定蛋白質(zhì)的溶解能力卻是不同的。在圖1-A、圖1-B中示意了對(duì)應(yīng)的區(qū)域1、2、3和4，在這些區(qū)域中可以發(fā)現(xiàn)A和B的溶解效力還是有細(xì)微差異的。如在區(qū)域1和4，A要優(yōu)于B；在區(qū)域3，B要優(yōu)于A；在區(qū)域2，兩者各自溶解了不同的蛋白質(zhì)?？偟膩碚f，含有4%CHAPS去垢劑的裂解液對(duì)水稻葉片疏水蛋白的溶解效果最佳。

3 討論與結(jié)論

目前有研究認(rèn)為SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果較好[6]，而ASB-14的溶解能力相對(duì)于SB3-10/CHAPS則更強(qiáng)[7]。本試驗(yàn)通過比較了幾種常用的裂解液對(duì)水稻葉片疏水蛋白的溶解效果后發(fā)現(xiàn)，CHAPS（4%）的溶解效果最好，CHAPS（2%）和SB3-10（2%）的組合次之，TritonX-100（4%）溶解效果較差，而ASB-14（4%）由于易造成酸性端低分子量區(qū)域模糊，因此效果最差。

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