肖 俊，許亮清，胡向萍，程周玉，胡寶慶，簡少卿，陽 鋼，文春根

(1.南昌大學生命科學學院，南昌，330031；2.南昌市科學院畜牧水產研究所，南昌，330038)

翹嘴鱖銅鋅超氧化物歧化酶重組蛋白表達、純化及特性分析

肖 俊1，許亮清2，胡向萍1，程周玉1，胡寶慶1，簡少卿1，陽 鋼1，文春根1

(1.南昌大學生命科學學院，南昌，330031；2.南昌市科學院畜牧水產研究所，南昌，330038)

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物體內超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶。根據翹嘴鱖 (Sinipercachuatsi) Cu/Zn-SOD基因序列 (GenBank登錄號: KJ558392.1) 設計表達引物，擴增獲得截去信號肽后的一段460 bp的序列，序列經過鑒定后，構建了重組表達質粒pET-30a+ScCu/Zn-SOD，并將該質粒轉入到BL21(DE3) 中，用IPTG誘導進行表達。經過優(yōu)化表達條件得到可溶的ScCu/Zn-SOD重組蛋白(rScCu/Zn-SOD)，純化重組蛋白后測定rScCu/Zn-SOD的濃度和酶活性。結果發(fā)現在20 ℃和37 ℃條件下均能夠誘導ScCu/Zn-SOD的表達。37 ℃時重組蛋白主要以包涵體形式存在。降低誘導溫度和補充Cu2+/Zn2+可提高rScCu/Zn-SOD的表達量。在20 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L ZnCl2于培養(yǎng)基中，重組蛋白的表達量明顯升高。純化后的重組蛋白濃度為0.14 mg/mL，酶活力為108.5 U/mg。rScCu/Zn-SOD最適溫度為37 ℃，最適pH為7.0，可耐受5% 濃度的SDS蛋白質變性劑。

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)；銅鋅超氧化物歧化酶；原核表達；蛋白特性

超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD)是生物體的重要抗氧化酶之一，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應生成過氧化氫和水，平衡機體氧自由基水平，避免活性氧簇 (Reactiveoxygenspecies, ROS)的毒害作用[1]。SOD分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三類，其中 Cu/Zn-SOD存在于真核生物的細胞漿內；Mn-SOD存在于真核生物和原核生物的線粒體中；Fe-SOD存在于原核細胞及少數植物細胞的葉綠體中[2]。

SOD不僅是一種抗氧化物酶，同時也是魚體內重要的非特異性免疫因子之一，具有抑制病菌侵害和增強機體免疫力等作用[3-4]。還可以作為魚類對水環(huán)境污染的指標[5]。魚體中SOD抗氧化酶基因的表達水平或活性的變化，反映了機體的氧化損傷或受環(huán)境脅迫的狀態(tài)[6,7]。鰱 (Hypophthalmichthysmolitrix) 在低氧脅迫條件下，肝和鰓組織的Cu/Zn-SOD mRNA表達水平顯著上調[8]。重金屬、過氧化氫及高溫脅迫均能引起盤鮑 (Haliotisdiscus)及萼花臂尾輪蟲 (Brachionuscalyciflorus) Cu/Zn-SOD mRNA的表達水平變化[9-10]。鰻弧菌 (Vibrioanguillarum) 刺激尖吻鱸 (Latescalcarifer) 后，其肌肉、鰓、肝臟和腎臟組織中的SOD mRNA表達量上調[11]。目前，已經從大西洋鮭魚 (Trematomusbernacchii)[12]、斑馬魚 (Daniorerio)[13]、黑鯛 (Sparusmacrocephlus)[14]和鰱[15]等魚體內成功克隆到Cu/Zn-SOD基因。另外，用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達和誘導出具有生物活性的斑馬魚和黑鯛Cu/Zn-SOD融合蛋白[13,14]。

翹嘴鱖 (Sinipercachuatsi) 廣泛分布于我國各大水系，是珍貴的淡水養(yǎng)殖魚類。目前，已經在鱖體內成功分離免疫球蛋白 (IgM、IgD和 IgZ)、β-防御素、溶菌酶、白介素、干擾素調節(jié)因子及抗病毒基因viperin等非特異性免疫因子[16-19]。然而，還未見鱖SOD的報道。本研究在克隆出翹嘴鱖Cu/Zn-SOD (命名為ScCu/Zn-SOD) 基因的基礎上[20]，構建了鱖Cu/Zn-SOD的重組表達質粒pET-30a+ScCu/Zn-SOD，在大腸桿菌中誘導表達出可溶性目的蛋白，純化了重組ScCu/Zn-SOD蛋白 (命名為rScCu/Zn-SOD)，并對重組蛋白的穩(wěn)定性進行了分析。以期為進一步研究SOD在魚類中的免疫機制及蛋白功能提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

翹嘴鱖由南昌市科學院畜牧水產所惠贈，平均體重(300±5.12)g，為人工網箱養(yǎng)殖。實驗之前，置于水族箱中暫養(yǎng)一周，期間采用連續(xù)不間斷充氣供養(yǎng)。

1.2 Cu/Zn-SOD 基因cDNA的 PCR 擴增

挑選健康的個體, 用Trizol法提取鱖肌肉總RNA。參照SMART cDNA Synthesis Kit (Clontech)操作手冊 (Clontech公司)合成SMART-cDNA。根據ScCu/Zn-SOD基因的編碼cDNA序列(GenBank accession no. KJ558392.1)，利用Primer 5.0軟件分析可用的酶切位點并設計表達引物ExCZSOD-F和ExCZSOD-R。上游表達引物ExCZSOD-F：GGAGAATTCATGGTACTAAAAGCTGTTTGTGTGT，含EcoRⅠ酶切位點(下劃線所示)和起始密碼子ATG；下游表達引物ExCZSOD-R：CCCAAGCTTTTACTGCGTGATGCCAATGACTC，含HindⅢ 酶切位點(下劃線所示)和終止密碼子TAA。引物5’ 端的3個堿基(GGA和CCC)為保護堿基，以保障堿基序列的粘性末端正常切開。以SMART-cDNA為模板，用高保真酶ExTaq 進行PCR擴增，PCR反應參數為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結束后，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，最后回收目的PCR產物。

1.3 重組表達質粒的構建

回收目的PCR產物和pET30-a(+) 載體分別用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ 進行雙酶切，酶切體系為 20 μL (10 μL H2O，6 μL DNA或質粒，1 μLEcoRⅠ，1 μLHindⅢ， 2 mL 10×H buffer)，37 ℃ 水浴酶切 4 h，酶切后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全。用純化試劑盒分別對酶切后的產物和質粒進行純化。純化后的DNA和質粒各 4 μL ，T4 DNA連接酶 1 μL ，T4 連接buffer 1 μL，總共 10 μL，4 ℃ 連接過夜。將連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，隨后涂布于固體LB平板(Kana+)，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，次日篩選陽性克隆測序和雙酶切驗證。

1.4 rScCu/Zn-SOD可溶性誘導條件優(yōu)化

將驗證的重組質粒 (pET-30a+ScCu/Zn-SOD) 熱激轉化E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細胞中，隨后涂布于固體LB平板 (Kana+)，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑取陽性克隆菌做PCR驗證。

將經驗證的陽性克隆按1∶50的比例分別加入到50 mL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)(Kana+)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD600 nm為0.6。取2 mL菌液作為未誘導的對照組，再加入異丙基硫代β-半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃，200 rpm條件下進行誘導表達，并在2、4、6、8 h時間點分別收集2 mL菌液，以0.5 mmol/L IPTG濃度下誘導6 h的DE3空白質粒菌液作為陰性對照。將上述收集的各管菌液7 000 r/min離心10 min后棄上清，分別用500 μL 1×PBS (162 mmol/L Na2HPO4, 38 mmol/L NaH2PO4, pH 7.4) 洗滌沉淀兩次后。再加 150 μL 1× PBS使沉淀中的菌體重懸，然后加入50 μL上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，5% DTT，2% SDS，0.1% 溴酚藍，10% 甘油)，混勻后95 ℃ 加熱10 min，采用10% 變性不連續(xù)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10% SDS-PAGE)電泳對表達產物進行檢測分析。

收集全部剩余菌液置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，棄上清，用1× PBS洗滌兩次，再用150 mL預冷的Binding buffer (300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 重懸菌體，充分混勻。然后超聲破碎(39 W，超聲15 s，間隔15 s，冰浴)細胞10 min，菌液澄清后，4 ℃ 7 000 r/min離心30 min，收集超聲破碎后上清與沉淀。挑取適量沉淀后加入1.5 mL離心管中，用500 μL 1×PBS重復洗滌2次后再用150 μL 1× PBS重懸，直接吸取150 μL上清置于1.5 mL離心管中，并且分別向2管中加入50 μL緩沖液，混勻后95 ℃ 加熱10 min，用10% SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測rScCu/Zn-SOD在上清及沉淀中的表達情況。

為進一步研究rScCu/Zn-SOD可溶性表達的最佳誘導條件，將20 μL pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達菌接種至1 mL LB液體培養(yǎng)基 (Kana+) 中，37 ℃ 過夜培養(yǎng)后，按1∶50的比例分裝到4瓶10 mL LB液體培養(yǎng)基 (Kana+)，設置A、B、C和D 4個誘導組。誘導組在37 ℃ 溫度條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng) 3 h 至OD600 nm為0.6，再分別加入0.5 mmol/L IPTG 誘導劑，同時在C組和D組中加入0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2添加劑誘導。誘導條件為A：37 ℃，未添加Cu2+/Zn2+； B：20 ℃，未添加Cu2+/Zn2+； C：37 ℃，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2； D：20 ℃，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2。誘導6 h后收集各組所得菌液，冰上超聲破碎 (39 W，超聲15 s，間隔15 s，冰浴)，10% SDS-PAGE電泳檢測各組rScCu/Zn-SOD可溶性表達。

優(yōu)化最佳誘導條件確定后，進行大量誘導表達。按1∶100的比例接種于100 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)至OD600 nm值為 0.6，加入IPTG (120 mg/mL) 終濃度 1 mmol/L，誘導最佳時間 6 h。

分裝誘導后的菌液，4 ℃ 4 100 g離心，收集菌體。每管菌體中加入6 mL預冷的1×Binding Buffer 重懸菌體，冰浴中超聲破碎(功率39 W，超聲15 s，間隔15 s)細胞10 min，至菌液澄清后4 ℃，7 000 r/min離心30 min，收集上清與沉淀，再通過10% SDS-PAGE電泳檢測rScCu/Zn-SOD在上清及沉淀中的表達情況。

1.5 rScCu/Zn-SOD的純化

取1 mL pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達菌加入100 mL液體LB培養(yǎng)基(Kana+)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD600 nm為0.6，再加入0.5 mmol/L CuSO4、0.1 mmol/L ZnCl2和0.5 mmol/L 終濃度的IPTG，在20 ℃ 條件下進行誘導，誘導6 h后取少量菌液用于1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測是否表達。將剩余的菌液進行超聲破碎，收集破碎后上清液用于純化。

參照AmerSham Biosciences 公司Ni2+離子親和層析方法純化重組蛋白，取超聲破碎后上清液加入到已平衡的Ni-NTA His.Bind 層析柱中，先用20 mmol/L 咪唑濃度的洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫柱子，再用300 mmol/L 咪唑濃度的洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白，收集目的蛋白并取少量進行SDS-PAGE電泳檢測。純化完成后，將收集的目的蛋白液加入到透析袋中，完全浸泡在1 L TGE透析液(50 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，10% 甘油，1% 甘氨酸，pH 8.0)中，4 ℃ 透析16 h以上。透析完成后，用干燥的聚乙二醇8 000進行蛋白濃縮，待袋內液體較少時將蛋白液分裝于2 mL的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 rScCu/Zn-SOD濃度的測定

采用Bradfard蛋白定量試劑盒(南京建成生物科技有限公司)測定重組 rScCu/Zn-SOD蛋白的濃度，重復取樣測定4次，最后根據所得標準曲線計算目的蛋白濃度。

表1 標準曲線的制備

注：樣品蛋白濃度=蛋白含量/所加樣品體積

1.7 rScCu/Zn-SOD酶活性的測定

參照超氧化物歧化酶試劑盒(測分型)(南京建成生物科技有限公司)說明書，采用黃嘌呤氧化酶法測定rScCu/Zn-SOD的酶活性。待測樣品中的Cu/Zn-SOD對超氧陰離子具有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管在550 nm處的吸光值會低于對照管的吸光值，通過計算可求出待測樣品中的Cu/Zn-SOD活力。計算公式為Cu/Zn-SOD活力=(A0-A1)×D/(A0×50%×C)，A0和A1分別表示對照管吸光值和測定管吸光值，D為待測樣品的稀釋倍數，C是待測蛋白的濃度。

1.8 溫度、pH和SDS對rScCu/Zn-SOD活性的影響

取純化好的rScCu/Zn-SOD，分別檢測溫度、pH和SDS變性劑對該蛋白Cu/Zn-SOD活性的影響，為減少測定數據的誤差，每個實驗設置3個平行組，并重復測定3次。溫度處理組中，將目的蛋白樣品分別置于4、25、37、50、60、70、80和90 ℃水浴中保溫10 min，再用酶標儀分別測定各組的吸光值，計算酶活性。pH處理組中，將蛋白樣品分別加入pH 2～11的緩沖體系中，室溫孵育1 h后測定酶活性。緩沖體系的配置分別為0.2 mol/L Citrate Buffer (pH 2.0、3.0、4.0、5.0和6.0)，0.2 mol/L Tris-HCl Buffer (pH 7.0、8.0和9.0)以及0.2 mol/L Glycine/NaOH Buffer (pH 10.0和11.0)。變性劑處理組中，目的蛋白樣品加入SDS至終濃度為1%～10%，室溫處理1 h后測定酶活性。相對酶活力以各組測得的最高酶活性為100%，與其它條件下處理后測得的活性比較后獲得相對酶活性作最終參考值，并用Excel繪制圖。

1.9 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數據結果用平均值±標準差(M±SD)表示。

2 結果

2.1 重組表達質粒雙酶切驗證

利用ExCZSOD-F和ExCZSOD-R引物擴增得到的ScCu/Zn-SOD基因表達片段大小為460 bp，pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達質粒經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后出現質粒和目的基因2個條帶，與預期大小相符(圖1)。測序結果顯示，回收得到的PCR產物序列與ScCu/Zn-SOD基因的編碼區(qū)DNA序列一致，表明ScCu/Zn-SOD+pET-30a重組表達質粒構建成功。

圖1 ScCu/Zn-SOD重組質粒的雙酶切驗證Fig.1 Identification of recombinant plasmid of ScCu/Zn-SOD by restriction enzyme digestion M.DNA Marker (DL2000);1.目的基因PCR產物;2.原始pET-30a質粒;3.重組后質粒;4.重組質粒雙酶切產物

2.2 原核誘導表達

預測ScCu/Zn-SOD的蛋白分子量為17.0 ku，His標簽分子量約為6.5 ku，所以ScCu/Zn-SOD融合蛋白大小約為23 ku。SDS-PAGE檢測發(fā)現，0.5 mmol/L IPTG終濃度誘導后菌體在23 ku處有蛋白表達(泳道1～5)，與預測蛋白大小一致。與陰性菌株(空白DE3，泳道8)和未誘導的陽性菌株(0 h，泳道1)相比，IPTG誘導后重組蛋白明顯表達，且隨著誘導時間的增加，其表達量也明顯增加(泳道1～5)；同時發(fā)現超聲破碎后的上清(泳道7)中也有可溶性的目的蛋白表達(圖2)。

圖2 重組ScCu/Zn-SOD的表達Fig.2 The expression of the recombinant ScCu/Zn-SODM.蛋白質Marker;1.未誘導的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;2.IPTG誘導后2 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;3.IPTG誘導后4 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;4.IPTG誘導后6 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;5.IPTG誘導后8 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;6.IPTG誘導8 h后的沉淀;7.IPTG誘導8 h后的上清;8.空白DE3菌。

2.3 rScCu/Zn-SOD的誘導條件優(yōu)化和純化

37 ℃誘導條件下，重組ScCu/Zn-SOD蛋白主要是以包涵體的形式存在于大腸桿菌菌液中(泳道1和5)。在誘導時補充Cu2+/Zn2+后可在上清中少量表達(泳道6)；20 ℃誘導條件下，雖然目的蛋白主要還是以包涵體的形式存在(泳道3,7)，但上清中也同樣有少量表達(泳道4,8)。補充Cu2+/Zn2+后，上清中的目的蛋白的表達量明顯升高(泳道8)。將20 ℃補充Cu2+/Zn2+誘導6 h后超聲上清中的目的重組蛋白進行純化，SDS-PAGE蛋白膠電泳檢測結果顯示，在23 ku處得到單一的目的蛋白條帶(圖3)。

圖3 重組ScCu/Zn-SOD的誘導條件優(yōu)化(A)及蛋白純化(B)Fig.3 The optimum induction condition (A) and protein purification (B) of the recombinant ScCu/Zn-SODA.不同條件下誘導重組ScCu/Zn-SOD蛋白在DE3中的蛋白表達。M.蛋白質Marker,1.37 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導后的沉淀;2.37 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導后的上清;3.20 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導后的沉淀;4.20 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導后的上清;5.37 ℃添加Cu2+/Zn2+誘導后的沉淀;6.37 ℃添加Cu2+/Zn2+誘導后的上清;7.20 ℃添加了Cu2+/Zn2+誘導后的沉淀;8.20 ℃添加了Cu2+/Zn2+誘導后的上清。B.rScCu/Zn-SOD的純化。

2.4 純化后rScCu/Zn-SOD的濃度和活性

標準曲線方程y=0.012 4x+0.037 9(圖4)。待測蛋白樣品OD595 nm的平均值為0.07，計算得到純化后rScCu/Zn-SOD的濃度為0.14 mg/mL，酶活性為108.5 U/mg。

圖4 BSA標準曲線Fig.4 Standard curve of BSA

2.5 溫度、pH和SDS對rScCu/Zn-SOD酶活性的影響

rScCu/Zn-SOD的酶活性在37 ℃最高，與其它溫度下測得的酶活性比較，在25～60 ℃保溫10 min后的rScCu/Zn-SOD的酶活性穩(wěn)定，相對酶活性保持在75%以上；低溫和高溫處理均會導致該酶活性的減弱，尤其在80 ℃以上高溫處理后，相對酶活性迅速降到20%以下(圖5A)。

在pH<4條件下，處理rScCu/Zn-SOD 1 h后，酶完全失活。隨著pH的升高酶活逐漸升高。在pH 7 時，酶活性最高；當pH>10時，酶活性迅速降低到30%以下(圖5B)。

以1%濃度的變性劑SDS處理后測得的酶活性為100%，隨著SDS濃度的升高，該酶活性呈下降趨勢，在5%濃度中的酶活性在70%以上，當SDS濃度升高到6%后，酶活性迅速降低到30%以下，表明該酶可耐受5%濃度的SDS(圖5C)。

圖5 溫度(A)、pH(B)和SDS(C)對重組ScCu/Zn-SOD蛋白酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature (A), pH (B) and SDS (C) on the enzyme activities of rScCu/Zn-SOD

3 討論

在多種生物中克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA通過重組蛋白表達系統(tǒng)均成功誘導表達出具有生物活性的融合蛋白[12,21-23]。褶紋冠蚌(Cristariaplicata)Cu/Zn-SOD通過構建pET-30a重組表達質粒，在大腸桿菌中成功誘導出0.6 mg/mL的高純度融合蛋白，酶活性高達5 300 U/mg[21]；人Cu/Zn-SOD與pGEX-2T構建的重組質粒，在大腸桿菌中獲得40%以上的高效表達，并分離和純化得到酶活1 210 U/mg的融合蛋白[23]；此外，從斑馬魚體內克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA與pET-20b質粒重組后在大腸桿菌中也誘導獲得酶活性為2 000 U/mL的融合蛋白[13]，黑鯛體內克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA與pET-20b質粒重組后在大腸桿菌中也誘導獲得酶活性為1 600 U/mL的融合蛋白[14]。當外源基因在體外快速轉錄表達過程中，翻譯后的肽鏈常常未能正常折疊，容易導致包涵體的形成[24]。ScCu/Zn-SOD在37 ℃誘導條件下，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，而在20 ℃誘導時，上清中出現了可溶性的目的蛋白，表明降低誘導溫度可實現蛋白體外的可溶性表達。另外，在誘導時通過添加Cu2+/Zn2+后可增加目的蛋白在上清中的表達量，說明在誘導時適量加入Cu2+/Zn2+離子也可促進Cu/Zn-SOD蛋白的可溶性表達。

重組誘導獲得的融合蛋白常帶有His、GST、HSV、Trx和Nus等特異性標簽蛋白，在金屬離子親和層析中可與相應的金屬離子特異性結合，從而可分離純化出所需目的蛋白[25]。在構建重組表達質粒過程中，通過表達載體引入His親和標簽可以進行重組蛋白純化。利用表達載體引入His親和標簽已經成功地獲得褶紋冠蚌[21]、海灣扇貝(Argopectenirradias)[22]、斑馬魚[13]和人[23]的重組Cu/Zn-SOD蛋白。本研究采用的pET-30a表達載體，帶有6個His組成的親和標簽，通過Ni離子親和層析純化后得到目的重組ScCu/Zn-SOD蛋白，并測得該蛋白濃度為0.14 mg/mL，Cu/Zn-SOD酶活力為108.5 U/mg。

Cu/Zn-SOD是一種金屬蛋白酶，酶活性受到溫度、pH、變性劑和金屬離子等因素的影響[26]。從羅非魚(Oreochromisniloticus)[27]、鯊魚(Scoliadonsorrakowah)[28]中提取的Cu/Zn-SOD蛋白均可耐受70～80 ℃高溫，表明天然形式的Cu/Zn-SOD蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性。重組得到的人Cu/Zn-SOD蛋白在25～70 ℃溫度范圍內具有穩(wěn)定的酶活性[23]。重組褶紋冠蚌Cu/Zn-SOD蛋白在10～60 ℃范圍內酶的活性維持在80%以上[21]。本研究中重組ScCu/Zn-SOD蛋白在25～60 ℃范圍內保持75%以上的酶活性，在80 ℃高溫下才出現酶活性大幅下降。因此，通過重組獲得的Cu/Zn-SOD蛋白具有與天然形式Cu/Zn-SOD蛋白相同的熱穩(wěn)定性。

金屬蛋白酶所含金屬離子在強酸環(huán)境中易脫落，而在強堿環(huán)境中其自身分子構象會發(fā)生不可逆變化，最終均會導致酶活性的減弱或喪失[29]。然而，可見紫外光譜和電子自旋共振顯示天然形式Cu/Zn-SOD酶結構在pH 5.3～9.5范圍內結構保持不變，顯示出極強的結構穩(wěn)定性[30]。重組褶紋冠蚌Cu/Zn-SOD蛋白在pH 2.0～9.0范圍內酶活性保持在75%以上[21]；重組人Cu/Zn-SOD蛋白在pH 5.0～10.5范圍內酶活性維持穩(wěn)定[23]；斑馬魚的重組Cu/Zn-SOD蛋白在pH 7.5～11范圍內均具有很高的酶活性[13]；海灣扇貝的重組Cu/Zn-SOD蛋白在pH 5.8～9.0范圍內均具有很高的酶活性[22]。另外，SDS作為一種蛋白質變性劑，可引起Cu/Zn-SOD蛋白分子構象和電荷分布的改變，從而影響其酶活性[31]。斑馬魚重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為6%的SDS[13]、褶紋冠蚌重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為8%的SDS[21]、人重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為7%的SDS[25]。本研究中rScCu/Zn-SOD可耐受SDS的濃度為5%，表明rScCu/Zn-SOD的酶活性相對穩(wěn)定。

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(責任編輯：張瀟峮)

Analysis and characterization on recombinant protein ofCu/Zn superoxide dismutase fromSinipercachuatsi

XIAO Jun1, XU Liang-qing2, HU Xiang-ping1, CHENG Zhou-yu1,HU Bao-qing1, JIAN Shao-qing1, YANG Gang1, WEN Chun-gen1

(1.SchoolofLifeSciences,NanchangUniversity,Nanchang, 330031,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandAquaculture,Nanchang, 330038,China)

Superoxide dismutases (SODs) are one family of important antioxidant enzymes involved in scavenging superoxide anion free radical in organisms. In the present paper, the expression primer was designed by Cu/Zn-SOD gene sequence ofSinipercachuatsi(named as ScCu/Zn-SOD, accession numbers: KJ558392.1). A truncated signal peptide sequence with 460 bp was amplified. After identification of the sequence, the constructed recombinant expression plasmid (pET-30a+ScCu/Zn-SOD) was transformed into BL21(DE3), and was expressed by induction with IPTG. The soluble recombinant protein of ScCu/Zn-SOD (designated as rScCu/Zn-SOD) was obtained by optimized expression condition, and the concentration and activity of rScCu/Zn-SOD was measured after the purification of recombinant protein. The results showed that the expression of ScCu/Zn-SOD could be induced under 20 ℃ and 37 ℃ conditions. The rScCu/Zn-SOD was mainly aggregated to form inclusion bodies at 37 ℃. The expression quantity of rScCu/Zn-SOD could be improved by reduction induction temperature and supplement Cu2+/Zn2+. The addition of 0.5 mmol/L CuSO4and 0.1 mmol/L ZnCl2in culture medium was optimal under 20 ℃ and 0.5 mmol/L IPTG condition, and the expression quantity of rScCu/Zn-SOD was obviously increased. The results can provide basic data for the research on functional characterization of SOD protein.

Sinipercachuatsi; Cu/Zn superoxide dismutase; Prokaryotic expression; Recombinant protein; Protein characterization

2016-08-04；

2016-11-02

南昌市科技支撐計劃項目(2012-KJ2C-NY-SC-002)；國家自然基金(31472305, 31460697, 21467015)；江西省教育廳項目(GJJ12024, GJJ10378)；江西省自然科學基金 (20132BAB204019)

肖 俊(1991-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水產動物疾病學。E-mail:874370756@qq.com 通訊作者：文春根。E-mail:cgwen@ncu.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)02-0011-07